宋安東，劉玉博，謝慧，王風(fēng)芹，鮑曉明

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002

2 山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟(jì)南 250100

利用轉(zhuǎn)座標(biāo)簽mTn-lacZ/leu2插入突變發(fā)酵性絲孢酵母2.1368-Leu?篩選高效產(chǎn)油突變株

宋安東1*，劉玉博1*，謝慧1，王風(fēng)芹1，鮑曉明2

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002

2 山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟(jì)南 250100

為提高微生物油脂產(chǎn)率，降低其生產(chǎn)成本，以轉(zhuǎn)座標(biāo)簽 mTn-lacZ/leu2插入突變發(fā)酵性絲孢酵母 2.1368-Leu?篩選高效產(chǎn)油突變株。利用LacZ顯色反應(yīng)、脂肪酸合成酶抑制劑Cerulenin和磷酸香草醛反應(yīng)，最終在玉米秸稈糖化液中篩選出一株高效產(chǎn)油突變株2.1368-Leu?-7。結(jié)果表明其油脂含量為38.30%，比對照的29.33%高了8.97%，而其產(chǎn)油率為8.35%，比對照的6.92%提高了20.63%；在玉米秸稈糖化液中的糖利用率為77%，每100 g玉米秸稈可轉(zhuǎn)化油脂8.32 g?？蔀槲磥砩锊裼彤a(chǎn)業(yè)提供了廉價原料。

轉(zhuǎn)座標(biāo)簽，磷酸香草醛反應(yīng)，玉米秸稈糖化液，生物柴油

Abstract:To improve microbial lipid production, we inserted mTn-lacZ/leu2 into Trichosporon fermentans 2.1368-Leu?to obtain high lipid production mutants. By observing the LacZ chromogenic change, the positive reaction between Cerulenin (inhibitor of fatty acid synthase) and phosphate vanillin, a higher lipid-producing mutant 2.1368-Leu?-7 grown on corn-stalk hydrolysate was obtained. The lipid content of this mutant reached 38.30% (8.97% higher than that of the control) and the lipid production rate was 8.35% (20.63% higher than that of the control). The rate of sugar utilization was 77%, meaning that 100 g corn-stalk could be converted to 8.32 g lipid. The study provided an effective method for microbial lipid production by using cheap raw materials for biodiesel.

Keywords:Trichosporon fermentans, transposon tagging, corn stalk, biodiesel

生物柴油是典型的“綠色能源”，大力發(fā)展生物柴油對發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)、推進(jìn)能源替代和減輕環(huán)境壓力具有重要的戰(zhàn)略意義[1-2]。當(dāng)前利用動植物油脂生產(chǎn)生物柴油，原料成本偏高，并且穩(wěn)定、充足的油脂原料供應(yīng)體系尚未形成。而微生物油脂發(fā)酵周期短，不受場地、季節(jié)、氣候變化等因素的影響；且產(chǎn)油微生物菌種資源豐富，能利用和轉(zhuǎn)化各種農(nóng)林廢棄木質(zhì)纖維素原材料，對農(nóng)業(yè)大國具有特殊的意義。因此，利用微生物轉(zhuǎn)化法獲取油脂具有非常大的發(fā)展?jié)摿3-4]。

轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)是根據(jù)轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變的特性而發(fā)展起來的研究基因功能的新方法。山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室利用 mTn3轉(zhuǎn)座標(biāo)簽對釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303.1A進(jìn)行誘變、篩選得到突變體263-H9，該突變體表現(xiàn)出對多種逆境脅迫敏感的表型特征，并最終確定了263-H9突變體的鹽敏感相關(guān)基因[5]。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)主要用于植物基因組和功能序列的分離與研究。任爭光等[6]利用轉(zhuǎn)座子 Mini-Tn5構(gòu)建致病菌株MH21的突變體庫，篩選得到 1株致病性完全喪失的突變體M543。對M543中轉(zhuǎn)座子插入基因的克隆和測序表明其突變基因為燕麥?zhǔn)乘峋笮头置谙到y(tǒng)(TTSS) 中的保守基因hrcR[6]。

發(fā)酵性絲孢酵母 Trichosporon fermentans 2.1368，酵母目隱球酵母科毛孢酵母屬，屬于茁芽毛孢酵母的一種，是可以進(jìn)行全糖發(fā)酵的產(chǎn)油酵母，具有易培養(yǎng)、木糖轉(zhuǎn)化率高等特點。近幾年，對發(fā)酵性絲孢酵母2.1368的研究主要集中在發(fā)酵條件的優(yōu)化，而對此菌株的改造尚未見報道。用濃度為 1.0 mg/mL的亞硝基胍，處理 1.0 h，誘變2.1368，得到2.1368的亮氨酸缺陷型2.1368-Leu?。本研究以2.1368的亮氨酸缺陷型2.1368-Leu?為出發(fā)菌株，采用轉(zhuǎn)座標(biāo)簽 mTn-lacZ/leu2插入突變的方法，篩選出一株在玉米秸稈糖化液發(fā)酵中產(chǎn)油率明顯提高的突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

菌種：發(fā)酵性絲孢酵母Trichosporon fermentans 2.1368，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；發(fā)酵性絲孢酵母Trichosporon fermentans 2.1368的亮氨酸營養(yǎng)缺陷型2.1368-Leu?，本實驗室篩選；大腸桿菌DH5α，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)系保藏菌種。

質(zhì)粒：mTn3轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽系列的 mTn-lacZ/leu2轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入文庫質(zhì)粒15個，編號分別為P21-P29、P31、P34-P38，山東大學(xué)鮑曉明教授贈送。mTn-lacZ/leu2轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入示意圖如圖1所示。

圖1 mTn-lacZ/leu2轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入文庫Fig. 1 Pools of the yeast genomic library with mTn-lacZ/leu2 transposon tagging.

轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入文庫是以 mTn3轉(zhuǎn)座標(biāo)簽對構(gòu)建于載體 pHSS6上的釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae染色體文庫進(jìn)行隨機(jī)插入而得。它具有38 bp的末端重復(fù)序列、res位點與lox位點，并加入了 Amp抗性標(biāo)記、Leu缺陷型標(biāo)記和沒有啟動子的報道基因LacZ，以及2個相同的Not ?酶切位點[7]。

1.1.2 試劑與溶液

2.24×103mol/L Cerulenin (淺藍(lán)菌素) 母液：5 mg Cerulenin充分溶解于10 mL DMSO (二甲基亞砜) 中。

磷酸香草醛試劑：0.12 g香草醛溶解于20 mL蒸餾水中，用85%的磷酸定容至100 mL。

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵性絲孢酵母2.1368菌種活化培養(yǎng)基 (麥芽汁培養(yǎng)基)：糖度為12-13波美度的麥芽汁，2%瓊脂。

2.1368營養(yǎng)缺陷型篩選基本培養(yǎng)基 (SD)[8](g/100 mL)：酵母氮源 (不含氨基酸) 0.67，葡萄糖2，瓊脂2，硫酸銨 0.5，pH 6.0，(或加腺嘌呤80 mg/L)。

YAPD培養(yǎng)基 (g/100 mL)：酵母浸膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，腺嘌呤80 mg/L，瓊脂2 (YAPD培養(yǎng)基加腺嘌呤可抑制ade1和ade2突變株的回復(fù)突變)。

X-gal顯色平板培養(yǎng)基(g/100 mL)：0.6 mL X-gal貯存液，Na2HPO43.5814，硫酸鎂0.0245，瓊脂1.6，pH 7.0。

發(fā)酵性絲孢酵母2.1368產(chǎn)脂培養(yǎng)基 (g/100 mL)：葡萄糖12，酵母膏0.8，蛋白胨0.3，KH2PO40.7，MgSO4·7H2O 0.1，乙醇 0.2，pH 5.8。

玉米秸稈糖化液發(fā)酵培養(yǎng)基：用體積分?jǐn)?shù)為1%的稀H2SO4于121 ℃預(yù)處理60 min后，加入蒸餾水調(diào)節(jié) pH值至 5.0，使固液比達(dá)到 10∶1，然后加入纖維素酶25 g/kg和木聚糖酶液20 mL/kg，120 r/min、50 ℃處理48 h，過濾除渣得糖化液。糖化液中總還原糖濃度為 5.2%，其中葡萄糖濃度為3.9%，木糖為1.2%，其余為雜糖。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)座標(biāo)簽文庫質(zhì)粒插入片段的獲得

將15個mTn-lacZ/leu2轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入文庫質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒用Not I酶切，并回收轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽文庫質(zhì)粒的插入片段 (8 kb左右)。

1.2.2 酵母的高效轉(zhuǎn)化方法[9]

將菌種 2.1368-Leu?用 100 mmol/L醋酸鋰(LiAc) 處理并懸浮細(xì)胞，每 100 μL等份分裝到1.5 mL EP管，離心后除去LiAc。按如下量加入轉(zhuǎn)化混合液：PEG 3350 (50%，W/V)，240 μL；1.0 mol/L LiAc，36 μL；單鏈載體 DNA (2.0 mg/mL)，25 μL；水和質(zhì)粒DNA，50 μL；劇烈振蕩后置28 ℃保溫30 min轉(zhuǎn)化酵母，然后于42 ℃水浴中熱激25 min。10 000 r/min高速離心30 s除去轉(zhuǎn)化混合液后，吸0.4 mL無菌水加到每個EP管中，懸浮沉淀，用等份的200 μL轉(zhuǎn)化混合液涂布選擇平板SD，28 ℃培養(yǎng)3 d左右。

本試驗用 P26號質(zhì)粒酶切回收片段為例研究2.1368-Leu?的最佳轉(zhuǎn)化熱激時間，設(shè)計10、15、20、25、30、35、40 min為熱激時間梯度。

1.2.3 同源重組質(zhì)粒的篩選

挑取 SD平板上生長出來的轉(zhuǎn)化子落涂片于YAPD平板上，每板的密度為100個鋪片，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用一張無菌濾紙將該平板復(fù)制于另一加有腺嘌呤的 SD平板上，28 ℃過夜。將濾紙取出，克隆面向上，置于一密閉容器中，容器底部加入10 mL氯仿處理10~30 min，取出濾紙，再將其克隆面向上置于X-gal平板 (120 μg/mL X-gal，0.1 mol/L Na2PO4和1 mmol/L MgSO41.6% 瓊脂糖)上，28 ℃條件下顯色1 d。

1.2.4 淺藍(lán)菌素Cerulenin初篩高產(chǎn)油脂酵母

確定2.1368原始菌株對Cerulenin的最小抑制濃度，即在每 10 mL 2.1368固體培養(yǎng)基中分別加入2.24×10?3mol/L的 cerulenin母液 0、10、20、30、40、50、60、70、80 μL制成梯度培養(yǎng)基，按照常規(guī)方法涂布平板，統(tǒng)計cerulenin對菌體菌落形成率的影響。

1.2.5 磷酸香草醛反應(yīng)篩選高產(chǎn)油脂突變株[10-11]

對初篩菌株進(jìn)行產(chǎn)脂培養(yǎng)后，取10 mL菌液，4 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗1~2次。定容至2 mL，取100 μL (對照取蒸餾水) 加入一帶塞試管中，加入18 mol/L的H2SO42 mL，沸水浴中孵化10 min，常溫水浴5 min，加入5 mL磷酸香草醛試劑，37 ℃保溫15 min，常溫水浴10 min，于530 nm測其OD值。

1.2.6 生物量的測定

通過4 500 r/min離心l0 min，收集菌體并干燥(干燥溫度：80 ℃) 至衡重，準(zhǔn)確稱取干菌體量。

1.2.7 發(fā)酵驗證試驗[12]

對所篩突變株在玉米秸稈糖化液中進(jìn)行發(fā)酵試驗驗證。其中

干菌體含油率=粗油脂重量/干菌體重量×100%。產(chǎn)油率=粗油脂重量/加入糖化液糖質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 所提取的轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入文庫質(zhì)粒及其 NotⅠ酶切結(jié)果

將 15個轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、挑取陽性克隆提取質(zhì)粒備用。純化后的質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ酶切，相應(yīng)質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物所得到的兩條帶。含有酵母同源序列和 mTn-lacZ/leu2轉(zhuǎn)座子的片段(6 654 bp) 不均一，約8~10 kb大小，而不含有酵母同源序列的載體pHSS6片段則大小一致，為2.1 kb。

2.2 發(fā)酵性絲孢酵母2.1368-Leu?的高效轉(zhuǎn)化

用回收后的DNA片段進(jìn)行酵母高效轉(zhuǎn)化，確定最佳熱激時間為20 min，適宜的熱激時間范圍擴(kuò)大至15~35 min。將15個轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入文庫質(zhì)粒采用以上轉(zhuǎn)化條件 (即熱激時間為20 min或25 min)轉(zhuǎn)化2.1368-Leu?，在SD篩選平板上得到的轉(zhuǎn)化子情況如表1所示。

由表1可以看出，經(jīng)過轉(zhuǎn)化試驗共得到166個轉(zhuǎn)化子，其中成功實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒為P22、P24、P25、P26、P27、P29、P31、P34、P35、P37、P38，用所得到的15個轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽文庫質(zhì)粒進(jìn)行酶切轉(zhuǎn)化，有4個沒有實現(xiàn)成功轉(zhuǎn)化。

表1 酵母高效轉(zhuǎn)化所得轉(zhuǎn)化子情況Table 1 Transformants gained by yeast efficient transformation

試驗中所用的轉(zhuǎn)座子的報道基因 LacZ沒有啟動子，缺失了前端的ATG序列，載體在Not I線性化之后重組片段自身就不攜帶啟動子，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)中，LacZ基因下游有—LEU基因，因此選用亮氨酸缺陷型的酵母菌株作為重組菌株，該菌株不能夠在缺少亮氨酸的 SD培養(yǎng)基上生長，只在含有上述轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的質(zhì)粒同源重組到酵母中，并且有啟動子在其上游啟動它轉(zhuǎn)錄，且能夠按三聯(lián)密碼子正確讀框，該重組酵母菌株才能夠編碼合成亮氨酸，從而在亮氨酸缺陷型的SD平板上生長。

2.3 同源重組質(zhì)粒的篩選

利用LacZ顯色反應(yīng)，根據(jù)其顯色水平，可以判斷LacZ基因前端的啟動子強(qiáng)弱。在含X-gal平板上對試驗中得到的 166個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行同源重組子篩選，結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，P26-3和P26-5號不顯藍(lán)色(圖中實箭頭所指)，其他P26號質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子藍(lán)色都較深，說明這兩個轉(zhuǎn)化子不是同源重組子，可能是閱讀框架錯誤，應(yīng)該是試驗誤差；P35和 P25號質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子藍(lán)色較弱，其中P25-5基本不顯藍(lán)色 (圖中方框處)，可能因為 LacZ基因上游的啟動子太弱，不能很好完成轉(zhuǎn)錄所致。因此，在用mTn-lacZ/leu2轉(zhuǎn)座標(biāo)簽對發(fā)酵性絲孢酵母進(jìn)行插入突變過程中，P22、P24、P26、P27、P29、P31、P34、P37 和 P38這9個質(zhì)粒是比較適合的同源載體。篩選166個轉(zhuǎn)化子，最終得到 139個同源重組子，可以作為篩選高產(chǎn)突變株的出發(fā)菌株。

2.4 優(yōu)良重組子的篩選

2.4.1 Cerulenin初篩高產(chǎn)油脂突變株

Cerulenin是一種藍(lán)色頭孢霉的自然代謝產(chǎn)物，它通過與脂肪酸合成酶中 β-酮脂酰-ACP合酶末端絲氨酸上的-SH基結(jié)合，形成羥基內(nèi)酰胺環(huán)而使之失活。β-酮脂酰-ACP合酶是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，故低濃度的Cerulenin能夠不可逆地抑制生物體的內(nèi)源性脂肪酸合成，從而抑制細(xì)胞的生長代謝。在一定濃度的Cerulenin培養(yǎng)基上，只有脂肪酸合成酶活性比較高的菌株才能存活下來而被選出[11]。

圖2 單菌落酵母轉(zhuǎn)化子在X-gal板上的顯色結(jié)果Fig. 2 The color result of transformant colony on X-gal plate.(a) The number of P38plasmid (13), P26(7), P31(3), P34(2). (b)The number of P37plasmid (23). (c) The number of P24plasmid(5), P26 (recovery) (43). (d) The number of P35plasmid (10),P25 (15), P22 (8). (e) The number of P26plasmid (16), P27 (16),P29 (5).

經(jīng)試驗確定當(dāng)2.24×10?3mol/L Cerulenin的量達(dá)到60 μL時，菌落形成率約為3%，以此濃度作為篩選最佳劑量。得到的重組子中，在Cerulenin作用下有部分菌落比出發(fā)菌株存活率高，相同Cerulenin抑制濃度下，選取菌落形成率比出發(fā)菌株大的作為初篩菌株，從32株菌中得到了15株可能高產(chǎn)油脂的突變株。

2.4.2 磷酸香草醛反應(yīng)法分析初篩突變株

經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)脂的酵母經(jīng)處理后進(jìn)行磷酸香草醛反應(yīng)，會生成一種有色物質(zhì)，其反應(yīng)體系的顏色從淺綠色到茶紅色，隨油脂含量的增加而加深[10]。將初篩后的15個重組子經(jīng)過產(chǎn)脂培養(yǎng)，其菌體通過磷酸香草醛反應(yīng)后，反應(yīng)顏色有明顯變化，根據(jù)顏色深淺可以判斷其含油率高低，從15株初篩突變株中選出10株顏色較深的突變株進(jìn)行OD值測定和油脂含量測定。

發(fā)酵產(chǎn)脂的酵母經(jīng)處理后進(jìn)行磷酸香草醛反應(yīng)后，其在530 nm處的光吸收值與氯仿甲醇抽提法測得的菌體油脂含量成正比，測得結(jié)果見表2。

表2 磷酸香草醛反應(yīng)法測定的初篩突變株OD530值和油脂含量Table 2 OD530results and lipid content results of primary screening mutants by the methods of phosphate and vanillin reaction

由表 2 可以看出，2.1368-Leu?-1、2.1368-Leu?-2、2.1368-Leu?-4 、 2.1368-Leu?-5 、 2.1368-Leu?-16 、2.1368-Leu?-7、2.1368-Leu?-8這幾個突變株的 OD值和油脂含量大于Ck (原始菌株) 或者和對照相當(dāng)，并且各重組子在 530 nm處的光吸收值與油脂含量基本上呈正相關(guān)。所以篩選這幾株菌進(jìn)行玉米秸稈糖化液發(fā)酵試驗。

2.4.3 發(fā)酵試驗復(fù)篩高產(chǎn)突變株

將上述 7個突變株進(jìn)行玉米秸稈糖化液發(fā)酵試驗，研究這7株突變對玉米秸稈糖化液的耐受性及利用纖維質(zhì)原料生產(chǎn)微生物油脂的轉(zhuǎn)化效率。發(fā)酵結(jié)果如表3所示。

表3 突變株在秸稈糖化液培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果Table 3 The fermentation results of the mutants under stalk saccharified liquid

由表3可以看出，發(fā)酵后這7個突變株的生物量均低于對照，其中突變株 2.1368-Leu?-1、2.1368-Leu?-2、2.1368-Leu?-4 的生物量低于 10 g/L，可能是由于突變株對秸稈糖化液中的有毒物質(zhì)比較敏感，導(dǎo)致生長受到抑制；突變株2.1368-Leu?-7的油脂含量最高，為 38.30%，比對照的 29.33%高了8.97%，并且2.1368-Leu?-7的產(chǎn)油率最高，為8.35%，而對照為6.92%，產(chǎn)油率比對照提高了20.63%?？梢源_定2.1368-Leu?-7為最佳高效產(chǎn)油突變株。

在2.1368-Leu?-7進(jìn)行玉米秸稈糖化液的發(fā)酵試驗中，其殘余總還原糖為1.20%，糖利用率為77%；每g糖可轉(zhuǎn)化油脂1.60 g；每100 g秸稈轉(zhuǎn)化油脂8.32 g。為微生物油脂的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

3 討論

通過試驗，確定最佳熱激時間為20 min。將15個轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入文庫質(zhì)粒在最佳熱激時間下轉(zhuǎn)化2.1368-Leu?，在 SD篩選平板上得到的 166株轉(zhuǎn)化子。其中成功實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒為P22、P24、P25、P26、P27、P29、P31、P34、P35、P37、P38。

利用LacZ顯色反應(yīng)，根據(jù)其顯色水平，對166株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行同源重組載體進(jìn)行篩選，得到 139株同源重組子。作為篩選高產(chǎn)菌的出發(fā)菌株。

利用Cerulenin和磷酸香草醛反應(yīng)篩選高產(chǎn)油脂酵母菌，并對初篩菌株進(jìn)行玉米秸稈糖化液發(fā)酵試驗驗證。最終確定 7號菌為最佳高效產(chǎn)油菌株，其油脂含量為38.30%，比對照的29.33%高了8.97%，而其產(chǎn)油率為 8.35%，比對照的 6.922%提高了20.63%；而在玉米秸稈糖化液中殘余總還原糖為1.20%，糖利用率為77%；每g糖可轉(zhuǎn)化油脂1.60 g；每100 g秸稈轉(zhuǎn)化油脂8.32 g。

本文參考文獻(xiàn)[9]和[13]，將幾種酵母轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行比較和改進(jìn)，最終確定了最佳轉(zhuǎn)化方法。在酵母轉(zhuǎn)化過程中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低的因素很多，如PEG濃度、熱激時間、單鏈載體、質(zhì)粒 DNA濃度等。通過多次試驗發(fā)現(xiàn)，混合液中質(zhì)粒 DNA添加4~5 μL (0.6 μg左右) 最佳，濃度較高時轉(zhuǎn)化效果并不理想，這可能是線性化質(zhì)粒串聯(lián)整合所致。

利用Cerulenin篩選高產(chǎn)油脂酵母，可以實現(xiàn)酵母的高通量篩選，方便易行，是一種比較理想的油脂酵母篩選方法。在磷酸香草醛反應(yīng)中，生物體與磷酸香草醛試劑反應(yīng)，生成一種紅色物質(zhì)，其機(jī)理尚不清楚，但根據(jù)反應(yīng)顏色的深淺即可以定性分析油脂含量的高低，該方法需要的生物量小，且無須細(xì)胞破碎便可直接對細(xì)胞油脂含量進(jìn)行定性分析，快速方便，具有很好的應(yīng)用前景。

本文僅完成了利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入突變篩選高產(chǎn)油脂突變株 2.1368-Leu?-7，初步分析該突變株仍是發(fā)酵性絲孢酵母。突變株的獲得，這只是酵母功能分析的第一步。要對酵母突變株進(jìn)一步研究，需要通過拯救質(zhì)粒pRSQ2-URA (實驗室已具有) 法確定轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入位點，根據(jù)拯救質(zhì)粒全序列設(shè)計并合成引物對驗證過的質(zhì)粒測序，將測序結(jié)果與釀酒酵母基因組全序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析，確定各轉(zhuǎn)座標(biāo)簽的插入位點，進(jìn)而對插入位點基因進(jìn)行深入分析。

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Journals.im.ac.cn

Screening of high lipid production Trichosporon fermentans mutants by transposon tagging mTn-lacZ/leu2 insertion

Andong Song1*, Yubo Liu1*, Hui Xie1, Fengqin Wang1, and Xiaoming Bao2
1 Life Science College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
2 State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, China

Received: November 24, 2010; Accepted: February 23, 2011

Supported by: Key Scientific and Technological Projects of Henan Province (No. 092102210110).Corresponding author: Xiaoming Bao. Tel: +86-531-88365826; E-mail: bxm@shu.edu.cn Andong Song. Tel: +86-371-63555153; Fax: +86-371-63555790; E-mail: song1666@126.com

*These authors contributed equally to this study.

河南省重點科技攻關(guān)項目 (No. 092102210110) 資助。