宋源泉，吳如春,2，許赟珍，范明,3，劉德華

1 清華大學(xué)化學(xué)工程系應(yīng)用化學(xué)研究所，北京 100084

2 廣西民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)工程學(xué)院 化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過(guò)程新技術(shù)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530006

3 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系，長(zhǎng)沙 410128

2,3-丁二醇生產(chǎn)菌株生產(chǎn)能力的比較和培養(yǎng)基優(yōu)化

宋源泉1，吳如春1,2，許赟珍1，范明1,3，劉德華1

1 清華大學(xué)化學(xué)工程系應(yīng)用化學(xué)研究所，北京 100084

2 廣西民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)工程學(xué)院 化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過(guò)程新技術(shù)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530006

3 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系，長(zhǎng)沙 410128

對(duì)5株克雷伯氏肺炎桿菌 (包括兩株乳酸途徑被敲除的工程菌株) 發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇能力進(jìn)行了比較，其中K. pneumonia HR521 LDH (乳酸合成途徑中l(wèi)dhA基因被敲除) 具有最佳的發(fā)酵性能。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了其發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組分，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為：葡萄糖 90 g/L，(NH4)2HPO43 g/L，玉米漿 (CLSP) 6 g/L，乙酸鈉 5 g/L，KCl 0.4 g/L，MgSO40.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g/L，MnSO40.01 g/L。在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，24 h發(fā)酵乙偶姻和2,3-丁二醇的終濃度為37.46 g/L，比未優(yōu)化前增加了10 g/L，2,3-丁二醇得率達(dá)到了理論得率的90.53%，生產(chǎn)強(qiáng)度1.56 g/(L·h)，檢測(cè)不到副產(chǎn)物乳酸的生成，利于后提取工藝的進(jìn)行和工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用。

2,3-丁二醇，克雷伯氏肺炎桿菌，發(fā)酵

Abstract:Five Klebsiella pneumonia strains (including two strains whose genes for lactic acid were knocked out) were used to produce 2,3-butanediol, in which K. pneumonia HR521 LDH (gene for lactic acid was knocked out) was the best for the production,and then the fermentation medium was optimized by orthogonal design. The optimum compositions were as follows: glucose 90 g/L,(NH4)2HPO43 g/L, CLSP 6 g/L, sodium acetate 5 g/L, KCl 0.4 g/L, MgSO40.1 g/L, FeSO4·7H2O 0.02 g/L, MnSO40.01 g/L. Under the above conditions, final concentration of acetone and 2,3-butanediol could reach 37.46 g/L, 10 g/L higher than that under the initial conditions, the yield was 90.53% of the theory, and the productivity was 1.5 g/(L·h), and no lactic acid was detected, which could be benefit for the downstream processing and industrial application.

Keywords:2,3-Butanediol, Klebsiella pneumonia, fermentation

2,3-丁二醇 (CH3CHOHCHOHCH3，2,3-Butanediol，2,3-BDO) 在常溫下是一種無(wú)色、無(wú)臭的透明液體[1-2]，分子中含有兩個(gè)手性碳原子，存在3種旋光異構(gòu)體，分別是 D-(-)-2,3-丁二醇、L-(+)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇[3]，作為一種大宗化學(xué)品(＜1 $/kg)，廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料、航空航天等領(lǐng)域，是石油替代戰(zhàn)略中的重要平臺(tái)化合物，本身可以作為燃料[4-6]、抗凍劑[7]、風(fēng)味添加劑[8-9]等，還可用來(lái)制備聚合物、油墨、香水、熏蒸劑、增濕劑和軟化劑、增塑劑、炸藥以及藥物的手性載體等[2,5,10-11]。鑒于 2,3-丁二醇具有廣泛的應(yīng)用，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展了大量的研究工作并獲得了較高的 2,3-丁二醇產(chǎn)量[12-13]。

本文以葡萄糖為碳源，比較了 5株克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-丁二醇的性能，選出其中高產(chǎn)2,3-丁二醇的菌株，并對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)用克雷伯氏肺炎桿菌Klebsiella pneumoniae 5株，由清華大學(xué)化工系應(yīng)用化學(xué)研究所分離并保藏，分別命名為 K. pneumoniae AC01，K. pneumonia HR521，K. pneumonia HR521 LDH (乳酸合成途徑中的基因ldhA被敲除)，K. pneumonia HR526，K. pneumonia HR526 LDH (乳酸合成途徑中的基因ldhA被敲除)。

乳酸途徑缺失菌株的構(gòu)建：在 K. pneumonia HR521和HR526在發(fā)酵生產(chǎn)的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乳酸，分流碳源，不利于目的產(chǎn)物的積累和后提取工作的開展。經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)生的乳酸以D型乳酸為主，通過(guò)敲除D型乳酸的關(guān)鍵表達(dá)基因ldhA可以有效地降低乳酸的產(chǎn)量，提高目的產(chǎn)物得率。具體敲除過(guò)程如下，首先，以K. pneumonia HR521或526總DNA為模板，正向引物序列為 5′-GGAATTCACGGTTG CGAACGGTATGTA-3′，反向引物序列為 5′-GCTC TAGAAGTGGTCTCCGAAATGCTGA-3′ (引物序列中包含EcoRⅠ和XbaⅠ限制性酶切位點(diǎn))，進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 擴(kuò)增獲得ldhA部分基因。將PCR獲得的ldhA部分基因連接到pMD18-T simple 載體質(zhì)粒，獲得pMD-ldh質(zhì)粒并測(cè)序。擴(kuò)增此質(zhì)粒，然后使用EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，獲得的ldhA基因片段連接到pGPCm自殺載體，得到的pGPCm-ldh使用凍融法導(dǎo)入到E. coli SM10中獲得重組菌。此重組菌作為供體與K. pneumonia HR521或526進(jìn)行接合轉(zhuǎn)化，然后通過(guò)氯霉素 (來(lái)自 pGPCm-ldh) 和氨芐 (來(lái)自K. pneumonia HR521或526) 雙抗性篩選獲得目的菌株K. pneumonia HR521或526 LDH。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[13]。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 70，玉米漿 (CSLP)8，(NH4)2HPO45，無(wú)水乙酸鈉 3，KCl 0.4，MgSO40.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO40.01，pH 7. 0，115 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：按 2%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，接種后的搖瓶于37 ℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.3 分析方法

生物量細(xì)胞干重 (DCW)：通過(guò)722S分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定，根據(jù)干重與OD600對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

底物及代謝產(chǎn)物的檢測(cè)：發(fā)酵底物及代謝產(chǎn)物使用SHIMADZU高效液相色譜(日本島津公司)，色譜柱為Aminex resin-based 87H柱，柱溫65 ℃，流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4，流速0.8 mL/min，檢測(cè)器為CTO.10vp折光示差檢測(cè)器，進(jìn)樣量為20 μL。

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9(34) 正交表安排實(shí)驗(yàn)，考察了葡萄糖、CSLP、(NH4)2HPO4和乙酸鈉濃度對(duì)發(fā)酵性能的影響，其他發(fā)酵組分濃度保持不變。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同克雷伯氏肺炎桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-丁二醇的比較

實(shí)驗(yàn)菌株為本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的 5株克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵條件為37 ℃，150 r/min，發(fā)酵時(shí)間24 h，進(jìn)行4組平行，2,3-丁二醇和主要副產(chǎn)物濃度如表 1所示。野生菌中，發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-丁二醇最優(yōu)菌株為HR521，然后是HR526，相對(duì)較差的菌株是AC01；乳酸合成途徑被敲除后，2,3-丁二醇的產(chǎn)量大大提高，亦即HR521 LDH和HR526 LDH發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-丁二醇能夠得到更高的產(chǎn)量，并且沒(méi)有副產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生。5株菌中，HR521 LDH發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇具有最佳的效果，副產(chǎn)物較少，檢測(cè)不到乳酸的生成，是比較理想的菌株。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果如表 2所示，各因素對(duì)發(fā)酵影響大小的順序依次為葡萄糖＞(NH4)2HPO4＞CSLP＞乙酸鈉，各因素效應(yīng)曲線如圖1所示，最終確定的發(fā)酵組成為：葡萄糖 90 g/L，(NH4)2HPO43 g/L，CSLP 6 g/L，乙酸鈉5 g/L。

2.3 最優(yōu)培養(yǎng)基驗(yàn)證

按照優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行 K. pneumonia HR521 LDH發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇，共進(jìn)行3組平行，24 h發(fā)酵結(jié)果表3所示。目的產(chǎn)物的終濃度較未優(yōu)化前增加了 10 g/L，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的二醇得率達(dá)到了理論得率的90.53%，生產(chǎn)強(qiáng)度1.56 g/(L·h)，檢測(cè)不到乳酸的生成，主要副產(chǎn)物為乙醇，利于產(chǎn)物的后提取。

表1 5株克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇的比較Table 1 Comparison of 5 different K. pneumonia strains to produce 2,3-butanediol

表2 K. pneumonia HR521 LDH 2,3-丁二醇發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 2,3-Butanediol fermentation with K. pneumonia HR521 LDH on orthogonal design

圖1 正交試驗(yàn)各因素效應(yīng)曲線Fig. 1 Effect curves of the factors on orthogonal design.

表3 K. pneumoniae HR521 LDH優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵Table 3 2,3-Butanediol fermentation by K. pneumoniae HR521 LDH on the optimized medium

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中的 5株克雷伯氏肺炎桿菌均具有發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇的能力，其中K. pneumonia HR521 LDH性能最佳，在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中發(fā)酵，目的產(chǎn)物濃度可高達(dá)37.46 g/L，得率達(dá)理論值的90.53%，并且檢測(cè)不到乳酸副產(chǎn)物的生成，在一定程度上減少了后提取的工藝操作單元，降低了后提取的成本，具有一定的工業(yè)應(yīng)用前景。

REFERENCES

[1] Magee RJ, Kosaric N. The microbial production of 2,3-butanediol. Adv Appl Microbiol, 1987, 32(1): 89?161.

[2] Syu MJ. Biological production of 2,3-butanediol. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 55(1): 10?18.

[3] Zhang LY. Research on 2,3-butanediol production by Serratia marcescens H30 and its metabolic regulation[D].Shanghai: East China University of Science and Technology, 2010.

張燎原. 粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-丁二醇及其代謝調(diào)控研究[D]. 上海: 華東理工大學(xué), 2010.

[4] Flichinger MC. Current biological research in conversion of cellulosic carbohydrates into liquidfuels: how far have we come. Biotechnol Bioeng, 1980, 22(Suppl 1): 27?48.

[5] Garg SK, Jain A. Fermentative production of 2,3-butanediol:a review. Bioresource Technol, 1995, 51(2/3): 103?109.

[6] Yu EC, Levitin N, Saddler JN. Production of 2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae grown on acid hydrolyzed wood hemicelluslose. Biotechnol Lett, 1982, 4(11): 741?746.

[7] Soltys KA, Batta AK, Koneru B. Successful nonfreezing,subzero preservation of rat liver with 2,3-butanediol and type I antifreeze protein. J Surg Res, 2001, 96(1): 30?34.

[8] Romano P, Granchi L, Caruso M, et al. The speciesspecific ratios of 2,3-butanediol and acetoin isomers as a tool to evaluate wine yeast performance. Int J Food Mircobiol, 2003, 86(1/2): 163?168.

[9] Bartowsky EJ, Henschke PA. The ‘buttery’ attritute of win-diacetyl-desirability, spoilage and beyond. Int J Food Microbiol, 2004, 96(3): 235?252.

[10] Xiu ZL, Zeng AP. Present state and perspective of downstream processing of biologically produced 1,3-propanediol and 2,3-butanediol. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(6): 917?926.

[11] Celińska E, Grajek W. Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects. Biotechnol Adv, 2009, 27(6): 715?725.

[12] Zhang LY, Sun JA, Hao YL, et al. Microbial production of 2,3-butanediol by a surfactant (serrawettin)-deficient mutant of Serratia marcescens H30. J Ind Microbial Biotechnol, 2010, 37(8): 857?862.

[13] Ma CQ, Wang AL, Qin JY, et al. Enhanced 2,3-butanediol production by Klebsiella pneumoniae SDM. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 82(1): 49?57.gilvosporeus by response surface methodology. J Chem Eng Chin Univ, 2006, 20(1): 68?73.

駱健美, 金志華, 岑沛霖. 褐黃孢鏈霉菌納他霉素發(fā)酵條件優(yōu)化. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào), 2006, 20(1): 68?73.

[14] Shen XL, Xia LM. Production and immobilization of cellobiase from Aspergillus niger ZU207. Process Biochem, 2004, 39: 1363?1367.

[15] Chen M, Xia LM, Xue PJ. Enzymatic hydrolysis of corncob and ethanol production from cellulosic hydrolysate. Int Biodeterior Biodegrad, 2007, 59: 85?89.

[16] Xu XP, Yuan SF, Liu LM. Optimization of culture medium for producing high β-glucosidase by Aspergillus niger mutant. J Food Sci Biotechnol, 2008, 27(5): 124?127.

許曉鵬, 袁士芳, 劉立明. 突變黑曲霉高產(chǎn) β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基優(yōu)化. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2008, 27(5):124?127.

[17] Tian YH, Zhang X, Li DY, et al. Study on the optimization of the fermentation medium of β-glucosidase produced by Aspergillus niger. Liquor-Making Sci Technol, 2010(3):20?23.

田毅紅, 張?chǎng)? 李德瑩, 等. 黑曲霉產(chǎn) β-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基的優(yōu)化研究. 釀酒科技, 2010(3): 20?23.

Comparison of 2,3-butanediol production by several strains and optimization of the fermentation medium

Yuanquan Song1, Ruchun Wu1,2, Yunzhen Xu1, Ming Fan1,3, and Dehua Liu1
1 Institute of Applied Chemistry, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China
2 College of Chemistry and Ecological Engineering, Guangxi University for Nationalities, Key Laboratory of Chemical and Biological Transforming Process, Nanning 530006, China
3 Department of Applied Chemistry, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

Received: November 23, 2010; Accepted: February 16, 2011

Corresponding author: Dehua Liu. Tel: +86-10-62794742; E-mail: dhliu@tsinghua.edu.cn