金麗華，方明月，張翀，蔣培霞，葛楠，李和平，邢新會，包成玉

1 清華大學化學工程系，北京 100084

2 清華大學工程物理系，北京 100084

常壓室溫等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母的條件及其突變株的特性

金麗華1，方明月1，張翀1，蔣培霞1，葛楠2，李和平2，邢新會1，包成玉2

1 清華大學化學工程系，北京 100084

2 清華大學工程物理系，北京 100084

采用新型常壓室溫等離子體射流誘變產(chǎn)油酵母，結(jié)合快速突變產(chǎn)油酵母操作條件及基于96孔板的高通量篩選手段，獲得了一系列增殖速度和產(chǎn)油量發(fā)生變化的突變株。在等離子體對菌株致死率為99%的條件下獲得的以突變株增殖速度為指標的正突變率達到27.2%。用含酵母粉 (10 g/L)、蛋白胨 (10 g/L) 及葡萄糖 (20 g/L) 的酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基進行發(fā)酵實驗表明，篩選得到的高產(chǎn)突變體產(chǎn)油量從對照株的1.87% (W/W) 增加到4.07% (W/W)。

常壓室溫等離子體，產(chǎn)油酵母，高通量篩選，誘變，油脂

Abstract:To obtain oleaginous yeast mutants with improved lipid production and growth rates, an atmospheric and room temperature plasma (ARTP) jet was used with a 96-well plate for high throughput screening. Mutants with changes in growth rates and lipid contents were obtained. At a lethality rate of 99%, the positive mutation rate of the yeast cells was 27.2% evaluated by the growth rates of the mutants and the comparison with the wild strain. The fermentation in a medium composed of yeastextract (10 g/L), peptone (10 g/L) and D-glucose (20 g/L) resulted in the lipid yield of the mutant (C4) with 4.07% (W/W) compared with that of the wild strain (1.87%).

Keywords:atmospheric and room temperature plasma (ARTP), oleaginous yeast, high throughput screening (HTS),mutation, lipid

當今世界化石燃料的過度消耗造成其儲備量日益減少，可再生能源的開發(fā)與研究日益重要[1]。利用微生物轉(zhuǎn)化生物質(zhì)生產(chǎn)生物柴油是解決能源短缺的途徑之一。利用微生物生產(chǎn)油脂有以下優(yōu)點：微生物生產(chǎn)油脂周期短、不受季節(jié)和氣候的影響、營養(yǎng)簡單、易于進行工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)等。但是也存在微生物的生產(chǎn)能力低、可用碳源種類有限等問題。獲取高增殖速度、高油脂含量的菌株成為微生物生物柴油實現(xiàn)工業(yè)化的瓶頸。為了篩選高效的油脂生產(chǎn)菌株，國內(nèi)外研究小組不斷從自然界中篩選優(yōu)良菌株[2]、優(yōu)化培養(yǎng)基來提高產(chǎn)量[3-4]，或者嘗試利用微波、紫外等物理誘變方法獲取高產(chǎn)菌株[5-6]。

本課題組自主研發(fā)了新型常壓室溫等離子體(ARTP) 微生物基因組快速突變技術(shù)。ARTP具有射流溫度低、產(chǎn)生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡易、成本低、與生物大分子和細胞作用明顯等優(yōu)點[7-8]，已成為快速突變微生物基因組的有效方法。前期的研究結(jié)果表明，ARTP技術(shù)可以快速有效地突變細菌、微藻、真菌、酵母等微生物[9-10]，能夠成為構(gòu)建多樣性豐富的突變庫的方法，為利用系統(tǒng)生物學和合成生物學手段構(gòu)建高性能菌株提供了平臺方法。

對產(chǎn)油酵母來說油脂含量是一個重要的指標，但其檢測方法復雜。傳統(tǒng)方法利用蘇丹紅染色法結(jié)合顯微鏡觀察來確定油脂量；或者直接利用有機溶液提取油脂，測量油脂干重[2,5-6,11]。但這些方法較為復雜，操作上耗時耗力，很難實現(xiàn)高通量篩選。利用芯片可以實現(xiàn)油脂含量高通量篩選[12]，但是芯片費用昂貴，也難以成為廣泛使用的篩選方法。Kimura等研發(fā)了基于尼羅紅熒光染色的油脂測定方法[13]，該方法操作簡單，重復性好，可用于構(gòu)建油脂高通量篩選方法。

本論文利用新型 ARTP育種方法誘變產(chǎn)油酵母圓紅冬孢酵母 Rhodosporidum toruloides，利用多孔板培養(yǎng)并結(jié)合胞內(nèi)油滴的熒光染色法建立快速簡便篩選突變體的方法，從而建立 ARTP快速誘變產(chǎn)油酵母的條件，并研究其突變株的特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及儀器

酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、尼羅紅、氯仿、甲醇等試劑均為分析純，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司 (中國)、Sigma Aldrich等公司。

1.1.2 菌株

圓紅冬孢酵母 Rhodosporidum toruloides ACCC 20341購自中國農(nóng)業(yè)生物菌種保藏管理中心(ACCC)。

1.2 培養(yǎng)方法及保存方法

YEPD液體培養(yǎng)基組成 (g/L)：酵母粉10、蛋白胨10、葡萄糖20。固體培養(yǎng)基在YEPD液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加2% (W/V) 瓊脂粉。菌株以用平板和三角瓶培養(yǎng) (液體培養(yǎng)條件：150 r/min，30 ℃)。傳代培養(yǎng)在固體平板上進行，培養(yǎng)好的平板放入4 ℃冰箱保管，每隔2周重新接種培養(yǎng)。

1.3 ARTP誘變方法

利用研究組自主開發(fā)的常壓室溫等離子體育種機 (ARTP) 進行酵母的誘變。該育種裝置操作簡單，在一定的電源功率、工作氣流量、等離子體發(fā)射源與樣品之間距離的條件下，誘變主要的可變操作參數(shù)是處理時間。本研究利用氦氣作為工作氣體，在表1所示的ARTP操作條件下，產(chǎn)生的等離子體溫度在25 ℃~35 ℃。為了尋找最佳的誘變條件，首先需要得到致死率曲線。因此處理時間從10 s開始，依次增加到240 s，然后將處理的樣品稀釋涂平板，利用CFU方法來計算致死率。

表1 ARTP誘變條件Table 1 Operating conditions using ARTP

1.4 高通量篩選方法

為了快速篩選增殖速度快且產(chǎn)油量多的突變體，本研究建立了利用多孔板的高通量篩選方法。48孔板適合培養(yǎng)1 mL菌液，而且在培養(yǎng)過程中可以連續(xù)直接檢測細胞吸光度，或者是結(jié)合96孔板檢測其吸光度和相對油脂量。這一過程操作簡便，96孔板一次可以檢測96個樣品，實現(xiàn)快速篩選。整體實驗流程如圖1所示。

圖1 ARTP誘變產(chǎn)油酵母及高通量篩選研究流程圖Fig. 1 Schematic diagram of the process of oleoginous yeast mutation by ARTP and the high throughput screening.

1.4.1 增殖速度

為了篩選出增殖速度快的菌株，誘變得出的平板上的單菌落利用1 μL的接種環(huán)接到48孔板的各個孔中培養(yǎng) (1 mL培養(yǎng)基/孔)，在30 ℃、150 r/min的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，并每隔6 h把100 μL樣品移到96孔板利用酶標儀 (DNA expert，Tecan，奧地利) 檢測600 nm處的光學密度來表征細胞濃度。根據(jù)細胞濃度-時間曲線，計算出對數(shù)生長期的酵母增殖速度。

1.4.2 細胞內(nèi)油脂量

每6 h從48孔板的培養(yǎng)液中取出100 μL菌液，先測600 nm的吸光度，然后再加5 μL尼羅紅溶液(0.1 mg尼羅紅/1 mL丙酮)，混勻后在37 ℃，避光條件下放置5 min后用酶標儀檢測胞內(nèi)油脂量。檢測時的發(fā)射光波長是 485 nm，吸收光波長是580 nm。為了計算油脂熒光強度，需要將測出的樣品熒光強度減去沒有加熒光劑的樣品的背景熒光強度。

1.5 其他分析方法

1.5.1 生物量測定

發(fā)酵液離心去上清，收集沉淀，加入蒸餾水離心洗滌 3次，105 ℃烘干，稱重。為了減少誤差，每個樣品做3個平行對照。

1.5.2 油脂提取

酵母的胞內(nèi)油脂的提取按照Wu等方法[14]進行。

1.5.3 遺傳穩(wěn)定性分析

為了分析突變株的遺傳穩(wěn)定性，在固體平板上進行了6代傳代培養(yǎng)，分析其增殖速度和產(chǎn)油能力。

1.5.4 突變率計算

誘變株的突變率的計算以增殖速度為準。增殖速度提高或降低20%以上的誘變株定義為突變株，增殖速度提高的突變株定義為正突變株。于是，突變率 (%) =突變株數(shù)/總誘變菌株數(shù)，正突變率 (%)=增殖速度提高20%以上的誘變株/總誘變菌株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死率曲線的測定

前期研究發(fā)現(xiàn)，等離子體對細菌細胞壁、細胞膜及蛋白質(zhì)都有顯著的作用效果，處理時間長會導致細胞壁部分或者完全破裂，釋放出細胞內(nèi)蛋白[15]。這是由于等離子體產(chǎn)生的活性粒子能夠破壞細胞結(jié)構(gòu)也能夠穿過細胞壁到達細胞內(nèi)，打斷基因、蛋白鍵等，從而導致大部分微生物死亡[16]。但少數(shù)經(jīng)過ARTP照射過的微生物會通過本身的自動修復系統(tǒng)修復存活，并在這一過程中產(chǎn)生基因突變。因此，選擇合適的 ARTP操作條件能夠?qū)崿F(xiàn)微生物的快速誘變。

如圖2所示，等離子體對圓紅冬孢酵母殺傷力比較強，ARTP處理10 s會殺死80%的菌體；處理60 s以后致死率達到90%以上；處理240 s致死率達到 100%。突變本身具有隨機性，其致死率和正突變之間的關(guān)系并不是十分清楚，主要取決于誘變方法和菌株本身的特性。本實驗為了便于選擇單菌落，選取致死率為99%的條件進行處理。

圖2 產(chǎn)油酵母的致死率曲線Fig. 2 Variaton of the lethal rate of the oleoginous yeast with the ARTP treatment time.

2.2 酵母突變體的快速篩選

高通量篩選是獲取目標誘變株的重要步驟之一。傳統(tǒng)的篩選方法利用蘇丹染色法染色，結(jié)合顯微鏡觀察判斷胞內(nèi)油脂含量。這種方法可以用于少量菌株的篩選，但是很難實現(xiàn)高通量快速篩選。本論文建立的方法可以快速簡便地實現(xiàn)幾百個誘變株的篩選，且篩選結(jié)果重復性高。將經(jīng)ARTP處理3 min的酵母稀釋到106個/mL，并涂在平板培養(yǎng)基上，每個平板能長出20~30個菌落。將菌落轉(zhuǎn)移到48孔板中培養(yǎng)，以實現(xiàn)高通量篩選。每6 h各取100 μL轉(zhuǎn)移到96孔板檢測吸光度，得出比增殖速度μ (h?1)，然后繼續(xù)加5 μL尼羅紅熒光染劑，避光放置5 min后檢測熒光強度。

圖 3給出了原始菌株和誘變菌株的相對增殖速度和油脂含量 (培養(yǎng)48 h，原始菌為1)。有12株誘變菌的增殖速度提高到原始菌的 1.2倍以上 (最高達到2.3倍)；以相對增殖速度為指標計算出的產(chǎn)油酵母的突變率為 47.2%，其中正突變率為 27.2%。挑選增殖速度和油脂產(chǎn)量都提高20%以上的突變株(C4，D4，F(xiàn)4，A7，A8和E8) 進行后續(xù)實驗。

2.3 遺傳穩(wěn)定性分析

圖3 原始菌和44個突變株 (培養(yǎng)48 h) 的相對增殖速度和相對油脂量 (虛線為原始菌的相對增殖速度和油脂量，實線是增殖速度和油脂量達到對照菌株1.2倍的位置)Fig. 3 The relative growth rates and lipid concentrations of the 44 mutants and the original strain (incubation for 48 h). The dotted line is for original strain, and solid line indicated the position where both relative growth rate and lipid concentration were 1.2 folds of those of the original strain.

為了檢測突變體的遺傳穩(wěn)定性，傳代過程中對各代的突變株進行增殖速度與油脂量分析。從 1代到 6代相對增殖速度與油脂量都保持穩(wěn)定。對第 4代和第6代進行了24 h的三角瓶培養(yǎng)，并檢測了此時的油脂干重以及油脂含量，分析結(jié)果表明，等離子體誘變的酵母突變體都保持著良好的遺傳穩(wěn)定性(表 2)。

表 2 傳代四次和六次后的突變體的油脂產(chǎn)量與油脂含量 (培養(yǎng)24 h)Table 2 The Lipid concentration and contents of the mutants at the forth and sixth subculture (incubation for 24 h)

2.4 高產(chǎn)突變株的發(fā)酵特性

經(jīng)過高通量篩選獲得的6株突變株 (C4，D4，F(xiàn)4，A7，A8和 E8) 的增殖速度及相對油脂量均提高到了原始菌的 1.2倍以上。為了檢測篩選到的菌株的準確油脂含量、了解這些高產(chǎn)突變株的培養(yǎng)特性，本文進行了三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)，并檢測了細胞的增殖速度及油脂含量。如圖 4、5所示，發(fā)酵 78 h后，原始菌的細胞干重達到了8.4 g/L，而增殖速度最快的突變株 (C4，E8) 的生物量達到了12.3 g/L，此外，突變株C4的油脂量達到原始菌的2.2倍左右。文獻中對圓紅冬孢酵母產(chǎn)油特性的研究表明[3]，酵母產(chǎn)油發(fā)酵有2個階段，第一個階段是細胞增殖期，第二階段是產(chǎn)油期，而且在產(chǎn)油培養(yǎng)基中，當葡萄糖濃度從10 g/L增加到90 g/L，產(chǎn)油量會從1.13 g/L達到8.63 g/L，而以40 g/L葡萄糖為碳源，圓紅冬孢酵母的油脂產(chǎn)量約為 2.5 g/L。在本研究采用的YEPD培養(yǎng)基中，當培養(yǎng)到40 h的時候，90%以上的葡萄糖已被消耗掉，這時候生物量增殖慢，細胞進入積累油脂期，因而油脂開始積累。突變株 C4在沒有優(yōu)化培養(yǎng)基的條件下，20 g/L葡萄糖培養(yǎng)基中的產(chǎn)油量達到了4.07 g/L，遠高于原始菌株，表明突變菌種的產(chǎn)油效率得到了提高。三角瓶發(fā)酵分析結(jié)果與高通量篩選結(jié)果趨勢一致，說明本文建立的高通量篩選方法可行，能夠用于高產(chǎn)油脂酵母的篩選。由于本論文是以 ARTP誘變酵母方法為主要研究目的，采用YEPD培養(yǎng)基獲得了油脂含量顯著提高的突變株，但對酵母發(fā)酵產(chǎn)油條件優(yōu)化包括培養(yǎng)基組成的優(yōu)化需要進一步的研究。

圖4 對照菌和6個突變株的細胞生長曲線Fig. 4 Cell growth curves of the six mutants and the original strain.

圖5 高產(chǎn)突變株和對照菌株的油脂含量比較 (圖里的數(shù)字表示相應(yīng)條件下油脂濃度 (g/L))Fig. 5 Comparisons of the lipid contents of the high-yield of lipid mutants and the original strain. The numbers in this figure represent the lipid concentrations (g/L) of the corresponding strains.

3 結(jié)論

本研究表明，ARTP誘變育種方法能夠快速有效地誘變產(chǎn)油酵母Rhodosporidium toruloides，而且突變效果良好。通過對44個誘變株的篩選，以增殖速度為指標的突變率為 47.2%，其中正突變率達到27.2%。以增殖速度和油脂產(chǎn)量為指標，建立了基于尼羅紅染色的高通量篩選方法，通過這種方法篩選到一株高產(chǎn)油脂的突變株 (C4)，該突變株在YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)78 h，產(chǎn)油量為原始菌的2.2倍，生物量也提高到了原始菌株的1.5倍。

REFERENCES

[1] Meng X, Yang JM, Xu X, et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renewable Energy, 2009,34(1): 1?5.

[2] Chanchaichaovivat A, Ruenwongsa P, Panijpan B.Screening and identification of yeast strains from fruits and vegetables: potential for biological control of postharvest chilli anthracnose (Colletotrichum capsici).Biological Control, 2007, 42(3): 326?335.

[3] Li YH, Zhao ZB, Bai FW. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 in fed-batch culture. Enzyme Microbial Technol, 2007,41(3): 312?317.

[4] Li YH, Liu B, Zhao ZB, et al. Optimization of culture conditions for lipid production by Rhodosporidium toruloides. Chin J Biotech, 2006, 22(4): 650?656.

[5] Pan LX, Yang DF, Huang SY, et al. Screening of oleaginous yeast by utilizing xylose by microwave irradiation mutation. China Brewing, 2009, 204(3): 62?64.

[6] Zhang J, Shen DH, Zheng XD. Researches on mutation breeding and fermantation conditions of oleaginous yeast.J Zhejiang Univ, 2009, 35(5): 497?502.

[7] Li HP, Li G, Sun WT, et al. Radio-frequency,atmospheirc-pressure glow discharges: producing methods, characteristics and applications in bio-medical fields. Complex Systems, 2008, 982: 584?591.

[8] Li G, Li HP, Wang LY, et al. Genetic effects of radio-frequency, atmospheric-pressure glow discharges with helium. Appl Physics Lett, 2008, 92(22): 221504.

[9] Wang LY, Huang ZL, Li G, et al. Novel mutation breeding method for Streptomyces avermitilis using an atmospheric pressure glow discharge plasma. J Appl Microbiol, 2010,108(3): 851?858.

[10] Wang LY. Studies on the mechanisms and applications of the atomospheric room temprature plasmas acting on the microbes. Beijing: Tsinghua University, 2010.王立言. 常壓室溫等離子體對微生物的作用機理及其應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D]. 北京: 清華大學, 2010.

[11] Asefa DT, M?retr? T, Gjerde RO, et al. Yeast diversity and dynamics in the production processes of Norwegian dry-cured meat products. Int J Food Microbiol, 2009,133(1/2): 135?140.

[12] Lin SS, Fischl AS, Bi XH, et al. Separation of phospholipids in microfluidic chip device: application to high-throughput screening assays for lipid-modifying enzymes. Anal Biochem, 2003, 314(1): 97?107.

[13] Kimura K, Yamaoka M, Kamisaka Y. Rapid estimation of lipids in oleaginous fungi and yeasts using Nile red fluorescence. J Microbiol Methods, 2004, 56(3): 331?338.[14] Wu SG, Hu CM, Jin GJ, et al. Phosphate-limitation mediated lipid production by Rhodosporidium toruloides.Biores Technol, 2010, 101(15): 6124?6129.

[15] Pompl R, Jamitzky F, Shimizu T, et al. The effect of low-temperature plasma on bacteria as observed by repeated AFM imaging. New J Physics, 2009, 11(11):115023.

[16] Morfill GE, Kong MG, Zimmermann JL. Focus on plasma medicine. New J Physics, 2009, 11(11): 115011.

Operating conditions for the rapid mutation of the oleaginous yeast by atmospheric and room temperature plasmas and the characteristics of the mutants

Lihua Jin1, Mingyue Fang1, Chong Zhang1, Peixia Jiang1, Nan Ge2, Heping Li2, Xinhui Xing1,and Chengyu Bao2
1 Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China
2 Department of Engineering Physics, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Received: December 1, 2010; Accepted: February 18, 2011

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2009CB724702), Korea Institute of Science and Technology (KIST),Japan Science and Technology Agency Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST), Japan and China Postdoctoral Science Foundation (No. 20080430367).

Corresponding author: Xinhui Xing. Tel/Fax: +86-10-62787472; E-mail: xhxing@tsinghua.edu.cn Heping Li. Tel/Fax: +86-10-62782816; E-mail: liheping@tsinghua.edu.cn

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2009CB724702)，韓國 KIST項目，日本 JST CREST項目，中國博士后科學基金項目 (No.20080430367) 資助。