凌宏志，葛菁萍，平文祥，許修宏

1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080

2 黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080

響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉HDF05產(chǎn)β-葡萄糖苷酶過程參數(shù)

凌宏志1,2，葛菁萍2，平文祥2，許修宏1

1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080

2 黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080

為獲得黑曲霉 Aspergillus niger HDF05菌株較高的 β-葡萄糖苷酶酶活，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察關(guān)鍵發(fā)酵操作參數(shù)對(duì)產(chǎn)酶的影響。繼而采用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域，并結(jié)合中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面對(duì)4個(gè)顯著性因素進(jìn)行分析。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵溫度、裝液量、麥麩和 (NH4)2SO4濃度對(duì) β-葡萄糖苷酶合成影響顯著。通過響應(yīng)面分析得到一元二階方程，對(duì)方程求解得到優(yōu)化的發(fā)酵過程參數(shù)：發(fā)酵溫度為28 ℃，裝液量為71.4 mL/250 mL，麩皮濃度為36 g/L，(NH4)2SO4濃度為5.5 g/L。采用該優(yōu)化的過程參數(shù)，菌株的最大產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力可達(dá)60.06 U/mL，較優(yōu)化前提高了23.9%。將黑曲霉HDF05產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶用于酸解玉米芯纖維殘?jiān)拿附鈱?shí)驗(yàn)中，可明顯降低纖維二糖的積累，48 h內(nèi)可使玉米芯纖維素殘?jiān)附獾寐蔬_(dá)到80.4%。

黑曲霉，β-葡萄糖苷酶，響應(yīng)面，過程參數(shù)優(yōu)化

Abstract:In order to obtain high β-glucosidase productivity, we optimized the fermentation parameters for β-glucosidase production by Aspergillus niger HDF05. First, we screened the important parameters by Plackeet-burman design. Second, we usedthe path of steepest ascent to approach to the biggest response region of parameters affecting β-glucosidase production. Then, we obtained the optimal parameters by central composite design and response surface analysis. We developed a quadratic polynomial equation for predicting β-glucosidase production level. The results showed that the important parameters were temperature, packing volume, concentrations of wheat bran and (NH4)2SO4. The optimal fermentation parameters were as follows: temperature 28 °C,packing volume 71.4 mL/250 mL, wheat bran 36 g/L and (NH4)2SO45.5 g/L. Under the optimal conditions, we obtained the maximum enzyme activity of 60.06 U/mL, with an increase of 23.9% compared to the original fermentation parameters. During enzymatic hydrolysis of acid-pretreated corncob, addition of β-glucosidase from Aspergillus niger HDF05 greatly reduced the inhibition caused by cellobiose, and the hydrolysis yield was improved from 66.7% to 80.4%.

Keywords:Aspergillus niger, β-glucosidase, response surface methodology, parameters optimization

我國纖維質(zhì)資源非常豐富，其中工業(yè)纖維質(zhì)廢渣每年有數(shù)千萬噸。如能利用生物技術(shù)手段將其中一部分轉(zhuǎn)化為酒精，無疑是解決現(xiàn)行酒精生產(chǎn)工藝中“與人爭糧”的重要途徑之一。而利用纖維質(zhì)為原料生產(chǎn)酒精，纖維素酶的作用在其中起到至關(guān)重要的作用。β-葡萄糖苷酶 (EC3.2.1.21)，又稱 β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，是纖維素酶系的一個(gè)組成成分，能夠參與纖維素的水解[1]。β-葡萄糖苷酶因其具有較高反應(yīng)溫度，較好的酸堿耐受性，從而比較適合工業(yè)生產(chǎn)使用。β-葡萄糖苷酶廣泛存在于植物、昆蟲和微生物中，而通過微生物發(fā)酵法是獲得該酶的主要途徑。目前發(fā)酵法生產(chǎn) β-葡萄糖苷酶主要采用木霉和曲霉，多數(shù)研究也以它們?yōu)槌霭l(fā)菌株[2-4]。但木霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中存在多種真菌毒素，有毒性嫌疑；另一方面 β-葡萄糖苷酶活力很低，因而其應(yīng)用范圍受到限制。黑曲霉能夠優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)多種纖維素酶，尤以 β-葡萄糖苷酶的活力較高，且性狀穩(wěn)定并具有較強(qiáng)的抗代謝阻遏能力，因此具有明顯的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[5]。國內(nèi)外對(duì)黑曲霉固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn) β-葡萄糖苷酶工藝都進(jìn)行了相關(guān)的研究并取得一定成果，由于固態(tài)發(fā)酵自身的一些缺陷，現(xiàn)階段研究大都集中在液態(tài)發(fā)酵。但目前黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn) β-葡萄糖苷酶酶活力還相對(duì)較低，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)菌株固然是一個(gè)解決方案，但對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化也是提高酶產(chǎn)量的一個(gè)有限途徑。本文對(duì)一株黑曲霉發(fā)酵過程參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期達(dá)到提高 β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的目的。

優(yōu)化發(fā)酵過程參數(shù)對(duì)產(chǎn)酶的影響通常采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，但其未考慮各成分之間的交互作用，因而無法提供未考察區(qū)域的信息，以及進(jìn)行預(yù)測和控制。響應(yīng)面法 (Response surface methodology，RSM) 是一種綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，可同時(shí)對(duì)多因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，并能快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最優(yōu)條件[6]。近年來 RSM 應(yīng)用于生物反應(yīng)過程的優(yōu)化已有很多報(bào)道[7-10]。本研究以一株產(chǎn) β-葡萄糖苷酶的黑曲霉HDF05為材料，首先采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響其產(chǎn) β-葡萄糖苷酶的各個(gè)因素進(jìn)行考察和評(píng)價(jià)，然后對(duì)篩選得到的重要因素采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (Central composite design) 進(jìn)行優(yōu)化，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合響應(yīng)面模型并進(jìn)行數(shù)學(xué)處理，得到最優(yōu)的發(fā)酵參數(shù)，以期為 β-葡萄糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 菌株

黑曲霉Aspergillus niger HDF05，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：使用PDA培養(yǎng)基[11]；發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g 麥麩，3 g蛋白胨，2 g K2HPO4，0.5 g MgSO4·7H2O，4 g (NH4)2SO4，0.5 g CaCl2，溶于1 000 mL蒸餾水中，自然pH。

1.1.3 主要試劑

對(duì)-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(p-NPG)由 Sigma 公司生產(chǎn)，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器

HQL300A 恒溫冷凍搖床 (中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠)；TGL-16B 高速臺(tái)式離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)；722S 紫外可見分光光度計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司)；PL1501-S電子天平 (梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子懸液的制備方法

用無菌水將斜面培養(yǎng)基上的孢子洗脫至250 mL 帶玻璃珠的三角瓶中，在搖床中200 r/min振蕩 30 min，而后將孢子濃度調(diào)整至 1×107個(gè)/mL制得種子液。以10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.2.2 β-葡萄糖苷酶粗酶液制備方法

從搖瓶中取發(fā)酵液，10 000 r/min條件下離心10 min，上清液即為β-葡萄糖苷酶粗酶液。

1.2.3 β-葡萄糖苷酶活力測定方法

取適當(dāng)稀釋的酶液 0.1 mL于試管中，加入20 mmol/L 的對(duì)-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷 (p-NPG)0.1 mL和pH 6.5磷酸緩沖溶液0.8 mL，50 ℃反應(yīng)30 min。向反應(yīng)體系中加入3 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在400 nm波長下測吸光度。加熱失活的酶液作為空白對(duì)照。酶活力的定義：在上述測定條件下每分鐘釋放出 1 μmol對(duì)-硝基苯酚所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位 (U)[12]。

1.2.4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)對(duì)黑曲霉HDF05發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶過程中各參數(shù)的單因素考察結(jié)果 (數(shù)據(jù)未列出)，在優(yōu)化初期利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法，以溫度 (X1)、裝液量 (X2)、麥麩 (X3)、蛋白胨 (X4)、(NH4)2SO4(X5)、MgSO4·7H2O (X6) 為試驗(yàn)因子，對(duì)這 6 種發(fā)酵過程參數(shù)進(jìn)行兩水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)為12次。擬合出線性方程：

式中：X1、X2、X3、X4、X5、X6分別為各發(fā)酵過程參數(shù)，Y為酶活力 (U/mL)，a0、a1、a2、a3、a4、a5、a6為方程系數(shù)。

1.2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)情形，在其他區(qū)域擬合方程與被近似的函數(shù)方程毫無相似之處，幾乎無意義。最陡爬坡試驗(yàn)以擬合的一階模型的回歸系數(shù)的符號(hào)和大小來設(shè)計(jì)(正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值) 顯著因素的最陡上升路徑，通過使主要因素同時(shí)朝響應(yīng)值增大的方向變化找出峰值，從而逼近最大響應(yīng)區(qū)域[13]。本試驗(yàn)可得到最接近最佳值的顯著因素取值，并將其作為中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)取值。

1.2.6 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

4因素5水平的中心組合實(shí)驗(yàn)共需30次實(shí)驗(yàn)，擬合出一個(gè)二次多項(xiàng)式方程。該方程可描述響應(yīng)變量與自變量的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?duì)于3因子模型，方程可表述為：

式中：X1、X2、X3、X5為由部分因子實(shí)驗(yàn)確定對(duì)響應(yīng)值有顯著影響的 4種發(fā)酵過程參數(shù)，Y為預(yù)測響應(yīng)值，即酶活力 (U/mL)，b0、b1、b2、b3、b5、b12、b13、b15、b23、b25、b35、b11、b22、b33、b55為方程系數(shù)。用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert (Version7.1.3)對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸分析，用F (Fischer) 檢驗(yàn)評(píng)價(jià)數(shù)學(xué)模型方程的顯著性，方程的擬合性由確定系數(shù) R2確定。

1.2.7 模型驗(yàn)證

對(duì)該多元函數(shù)進(jìn)行簡單的性狀分析便可確定出其最大酶活點(diǎn)以及取得最大酶活的相應(yīng)的發(fā)酵過程參數(shù)的取值，采用最終所得的優(yōu)化培養(yǎng)基組成對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，如模型可靠便可確定黑曲霉HDF05發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝。

1.2.8 纖維原料預(yù)處理

玉米芯預(yù)處理方法按文獻(xiàn)[14]所述，預(yù)處理后纖維殘?jiān)煞譃椋豪w維素 54%，半纖維素 5.3%，木質(zhì)素29.2%，其他11.5%。

1.2.9 添加β-葡萄糖苷酶粗酶液酶解玉米芯纖維殘?jiān)?/p>

酶解在50 mL磨口錐形瓶中進(jìn)行，底物質(zhì)量濃度為130 g/L，加入一定量按1.2.2方法制備的粗酶制劑 (纖維素酶用量為20 U/g底物，β-葡萄糖苷酶用量為3 U/g底物)，在 pH值 4.8、45 ℃條件下水解。酶解得率(Y)按下式計(jì)算：

式中：m-還原糖總量，m1-底物中纖維素質(zhì)量，m2-底物中半纖維質(zhì)量。

1.2.10 酶解液中糖分分析方法

玉米芯纖維殘?jiān)附夂?，酶解液中各種糖分的分析按文獻(xiàn)[15]所述方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 重要因素的篩選

采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)發(fā)酵過程中6 個(gè)過程參數(shù)進(jìn)行考察，每個(gè)因子取高 (+1) 和低(?1) 2個(gè)水平 (表1)。各因素所代表的參數(shù)水平和方差分析結(jié)果見表2。

表2結(jié)果表明，研究的6個(gè)因素中，發(fā)酵溫度、裝液量、麩皮和硫酸銨的濃度對(duì) β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量存在顯著影響，并進(jìn)行下一步最陡爬坡試驗(yàn)。而其他2個(gè)因素，蛋白胨和MgSO4·7H2O對(duì)β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量沒有顯著影響。因此在后續(xù)試驗(yàn)中的取值確定為Plackett-burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的高點(diǎn)取值。而各因素對(duì)產(chǎn)酶的影響可用以下方程表示：

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table 1 Plackett-Burman design and responding value

表2 各種因素的影響Table 2 Effects of different factors

方程的決定系數(shù) R2=0.9980，表明該回歸方程擬合良好。由顯著因子效應(yīng)可看出，要提高產(chǎn)酶量，應(yīng)適當(dāng)提高裝液量、麥麩和 (NH4)2SO4濃度，降低溫度。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)研究最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的臨近區(qū)域里才能充分近似真實(shí)情況，故應(yīng)先逼近最大產(chǎn)酶區(qū)域后再建立有效的擬合方程。根據(jù)Plackett-Burman法篩選出的顯著因子效應(yīng)大小設(shè)計(jì)它們的步長，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，尋找最大產(chǎn)酶區(qū)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。最大產(chǎn)酶區(qū)在第3次試驗(yàn)附近，故以試驗(yàn)3的條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表4。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of steepest ascent

表4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factors and level value of response surface analysis

2.3 中心組合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基濃度

采用Central composite design響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定顯著因子的最優(yōu)水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表 5。由Design-Expert (Version7.1.3) 軟件擬合得到多元回歸模型：

模型回歸分析見表6。決定系數(shù)R2=0.8948，說明回歸方程的擬合較好。模型的P<0.0001，該值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05，表明回歸方程的F檢驗(yàn)顯著，所擬合的二次回歸方程適合。由響應(yīng)面回歸分析和回歸方程擬合繪制響應(yīng)面圖形 (圖1)。

表5 中心組合響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Response surface central composite design and corresponding response

表6 回歸分析結(jié)果Table 6 Results of regression analysis

圖1 裝液量和麥麩濃度對(duì)酶活力影響的響應(yīng)面圖Fig. 1 Surface layer of the mutual-affection of packing volume and wheat bran concentration on enzyme activity.

由圖 1的三維響應(yīng)面圖可看出，X1、X2、X3、X5存在極值點(diǎn)。對(duì)方程求導(dǎo)，得到模型的極值點(diǎn)，4個(gè)因子最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn) (X1、X2、X3、X5) 的代碼值 (0.09、0.28、0.08、1.00)，即發(fā)酵溫度為 28.09 ℃，裝液量為 71.37 mL/250 mL，麩皮濃度為 36.17 g/L，(NH4)2SO4濃度為 5.5 g/L，此時(shí)模型預(yù)測的極大值為59.33 U/mL。為實(shí)際操作方便，確定培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為：發(fā)酵溫度為 28 ℃，裝液量為 71.4 mL/250 mL，麩皮濃度為 36 g/L，(NH4)2SO4濃度為5.5 g/L。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在其余培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件不變的情況下，在初始發(fā)酵條件和優(yōu)化發(fā)酵條件下分別進(jìn)行3組搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，初始發(fā)酵條件所得酶活分別為46.13、45.26、45.71 U/mL，平均酶活力為45.7 U/mL，優(yōu)化發(fā)酵條件所得酶活分別為 60.54、59.54、60.11 U/mL，平均酶活力為60.06 U/mL，條件優(yōu)化后酶活提高了 23.9%，與模型預(yù)測值非常接近，說明該數(shù)學(xué)模型能準(zhǔn)確預(yù)見實(shí)際發(fā)酵情況。

利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法優(yōu)化黑曲霉發(fā)酵產(chǎn) β-葡萄糖苷酶已有一些報(bào)道[16-17]。許曉鵬等[16]以正交試驗(yàn)法對(duì)黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使其 β-葡萄糖苷酶活力達(dá) 59.86 U/mL。田毅紅等[17]采用單因素試驗(yàn)法對(duì)產(chǎn) β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，獲得最高 β-葡萄糖苷酶活力為 54.15 U/mL。本研究對(duì)黑曲霉HDF05發(fā)酵過程參數(shù)優(yōu)化后產(chǎn)酶能力處于較優(yōu)水平。

2.5 玉米芯纖維殘?jiān)拿附?/h3>

玉米芯纖維殘?jiān)?(含纖維素54%，半纖維素5.3%，木質(zhì)素 29.2%) 用纖維素酶和 β-葡萄糖苷酶酶解 (纖維素酶用量為20 U/g底物，β-葡萄糖苷酶用量為3 U/g底物)。酶解48 h之后，酶解液中各組分含量見表 7。單獨(dú)使用纖維素酶進(jìn)行酶解時(shí)，還原糖濃度達(dá)到52.1 g/L，酶解得率為66.7%，而纖維素酶與β-葡萄糖苷酶一起使用時(shí)，還原糖濃度可達(dá)63.4 g/L，酶解得率可達(dá) 80.4%。這說明在單獨(dú)使用纖維素酶進(jìn)行玉米芯纖維殘?jiān)拿附鈺r(shí)，纖維素酶的酶活在纖維二糖積累到一定程度時(shí)受到抑制，而加入 β-葡萄糖苷酶可起到降解纖維二糖從而解決纖維素酶酶活被抑制的問題，進(jìn)一步提高酶解的得率。

表7 不同酶處理對(duì)酶解玉米芯纖維殘?jiān)挠绊慣able 7 Results of hydrolysis by cellulase and β-glucosidase from A. niger HDF05

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面優(yōu)化法可快速篩選影響黑曲霉HDF05菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵過程參數(shù)的顯著因素，并通過建立多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，采用統(tǒng)計(jì)分析對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)來優(yōu)化發(fā)酵過程參數(shù)。優(yōu)化得到的最優(yōu)發(fā)酵過程參數(shù)為：發(fā)酵溫度為28 ℃，裝液量為71.4 mL/250 mL，麩皮濃度為36 g/L，(NH4)2SO4濃度為 5.5 g/L。在優(yōu)化的條件下，黑曲霉 HDF05菌株的β-葡萄糖苷酶活力達(dá)60.06 U/mL，較優(yōu)化前提高了23.9%。將黑曲霉HDF05產(chǎn)生的β-葡萄糖苷用于酸解玉米芯纖維殘?jiān)拿附鈱?shí)驗(yàn)中，48 h可使酶解玉米芯纖維素殘?jiān)寐噬?0.4%。

REFERENCES

[1] Zhao LG, Zhou TC, Meng P. Screening of β-glucosidase producing strain and analysis of cellulase composition. Ind Microbiol, 2007, 37(5): 47?50.

趙林果, 周潭澈, 孟鵬. β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選及其所產(chǎn)纖維素酶酶系組成分析. 工業(yè)微生物, 2007,37(5): 47?50.

[2] Yan HP, Chen SH, Wu XQ. Review of the study on β-glucosidase from Aspergillus niger. J Cellul Sci Tech,2007, 15(1): 59?63.

閆會(huì)平, 陳士華, 吳興泉. 黑曲霉 β-葡萄糖苷酶的研究進(jìn)展. 纖維素科學(xué)與技術(shù), 2007, 15(1): 59?63.

[3] Zhang HB, Chen XD, Hu XQ, et al. Study on fermentation conditions of Trichoderma reesei for producing cellulase.Food Sci, 2008, 29(11): 375?378.

張洪斌, 陳賢東, 胡雪芹, 等. 一株里氏木霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的研究. 食品科學(xué), 2008, 29(11): 375?378.

[4] Martins LF, Kolling D, Camassola M, et al. Comparison of Penicillium echinulatum and Trichoderma reesei cellulases in relation to their activity against various cellulosic substrates. Bioresour Technol, 2008, 99(5):1417?1424.

[5] Nielsen J. Modelling the growth of filamentous fungi. Adv Biochem Eng Biotechnol, 1992, 46: 187?223.

[6] Montgomery DC. Design and Analysis of Experiments.5th ed. New York: John Wiley and Sons, 2001: 451?463.

[7] Li W, Du W, Liu, DH. Optimization of whole cell-catalyzed methanolysis of soybean oil for biodiesel production using response surface methodology. J Mol Catal B: Enzym, 2007, 45(3/4): 122?127.

[8] Wang P, Sun LM, He JY. Medium optimization for enhanced production of carbonyl reductase by Candida tropicalis 104 by response surface methodology. Chin J Biotech, 2009, 25(6): 863?868.

王普, 孫立明, 何軍邀. 響應(yīng)面法優(yōu)化熱帶假絲酵母104菌株產(chǎn)羰基還原酶發(fā)酵培養(yǎng)基. 生物工程學(xué)報(bào),2009, 25(6): 863?868.

[9] Shen NK, Wang QY, Lu Y, et al. Enhancing ethanol production using thermophilic yeast by response surface methodology. Chin J Biotech, 2010, 26(1): 42?47.

申乃坤, 王青艷, 陸雁, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化耐高溫酵母生產(chǎn)高濃度乙醇. 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(1): 42?47.

[10] Sampaio FC, De Faveri D, Mantovani HC, et al. Use of response surface methodology for optimization of xylitol production by the new yeast strain Debaryomyces hansenii UFV-170. J Food Eng, 2006, 76(3): 376?386.

[11] Shen P, Fan XR, Li GW. Microbiology Experiment. 3rd ed. Beijing: Higher Education Press, 1999.

沈萍, 范秀容, 李廣武. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn). 3版. 北京: 高等教育出版社, 1999.

[12] Cai YJ, Buswell JA, Chang ST. β-glucosidase components of the cellulolytic system of the edible straw mushroom,Volvariella volvacea. Enzyme Microb Technol, 1998,22(2): 122?129.

[13] Luo JM, Jin ZH, Cen PL. Optimization of protoplast regeneration medium composition for Streptomycesgilvosporeus by response surface methodology. J Chem Eng Chin Univ, 2006, 20(1): 68?73.

駱健美, 金志華, 岑沛霖. 褐黃孢鏈霉菌納他霉素發(fā)酵條件優(yōu)化. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào), 2006, 20(1): 68?73.

[14] Shen XL, Xia LM. Production and immobilization of cellobiase from Aspergillus niger ZU207. Process Biochem, 2004, 39: 1363?1367.

[15] Chen M, Xia LM, Xue PJ. Enzymatic hydrolysis of corncob and ethanol production from cellulosic hydrolysate. Int Biodeterior Biodegrad, 2007, 59: 85?89.

[16] Xu XP, Yuan SF, Liu LM. Optimization of culture medium for producing high β-glucosidase by Aspergillus niger mutant. J Food Sci Biotechnol, 2008, 27(5): 124?127.

許曉鵬, 袁士芳, 劉立明. 突變黑曲霉高產(chǎn) β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基優(yōu)化. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2008, 27(5):124?127.

[17] Tian YH, Zhang X, Li DY, et al. Study on the optimization of the fermentation medium of β-glucosidase produced by Aspergillus niger. Liquor-Making Sci Technol, 2010(3):20?23.

田毅紅, 張鑫, 李德瑩, 等. 黑曲霉產(chǎn) β-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基的優(yōu)化研究. 釀酒科技, 2010(3): 20?23.

Fermentation optimization by response surface methodology for enhanced production of β-glucosidase of Aspergillus niger HDF05

Hongzhi Ling1,2, Jingping Ge2, Wenxiang Ping2, and Xiuhong Xu1
1 College of Resource and Environment, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
2 Key Laboratory of Microbiology, College of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China

Received: August 2, 2010; Accepted: November 11, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA100702-6), Key Technology Research and Development Program of Heilongjiang Science and Technology Bureau (No. GA07B401-6), Special Fund for Scientific and Technological Innovative Talents in Harbin (No. RC2010XK002028), Educational Commission of Heilongjiang Province of China (No. 11551z011), National Natural Science Foundation of China (No. 31070446), High-level Talents (Innoration Team) Projects of Heilongjiang University (No. hdtd2010-17).

Corresponding author: Xiuhong Xu. Tel: +86-451-55191137; E-mail: howard2857@hotmail.com Wenxiang Ping. Tel: +86-451-86608046; E-mail: wenxiangp@yahoo.com.cn

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2007AA100702-6)，黑龍江省科技攻關(guān)重大項(xiàng)目 (No. GA07B401-6)，哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金 (No. RC2010XK002028)，黑龍江省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 11551z011)，國家自然科學(xué)基金 (No. 31070446)，黑龍江大學(xué)高層次人才 (創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)) 支持計(jì)劃 (No. hdtd2010-17) 資助。