談 艷,陳文鶴,郭 黎,孫慶艷

運動、膳食干預對瘦素抵抗大鼠中樞受體后信號通路作用機制的研究

談 艷1,陳文鶴2,郭 黎2,孫慶艷3

大多數(shù)肥胖癥患者體內表現(xiàn)為高瘦素(Leptin)水平及對瘦素治療不敏感,提示其存在瘦素抵抗現(xiàn)象,而飲食誘導的肥胖通常與中樞瘦素抵抗和外周瘦素抵抗相聯(lián)系[39]。瘦素主要是通過中樞限制食物的攝入和增加能量消耗而達到控制體重的目的,因此,弄清中樞瘦素抵抗的發(fā)生機制顯得尤為重要。關于瘦素抵抗發(fā)生眾多機制的研究中,細胞因子信號轉導抑制蛋白3(SOCS3)被認為是瘦素抵抗、胰島素抵抗信號通路的負性調節(jié)因子之一。特別是它對瘦素在中樞神經系統(tǒng)中敏感性調節(jié)起到關鍵性的作用,而運動、膳食干預又是改善肥胖的主要手段之一[20,30]。目前,關于運動與瘦素的研究較多,但有關運動、膳食干預對SOCS3、中樞長型瘦素受體(LP-Rb)及其受體后Janus激酶-轉錄子的單轉導體和活化體(JAK-STAT)通路的影響卻鮮有報道。因而,探討 SOCS3在運動、膳食干預下的變化及其在瘦素抵抗中的作用,將為瘦素抵抗發(fā)生機制的研究提供新視角,為推廣運動聯(lián)合膳食調控的科學減肥方法提供實驗依據(jù)。

盡管目前關于瘦素抵抗取得了一定的研究進展,但仍然有一些問題需要進一步展開研究和討論:1)中樞瘦素抵抗發(fā)生的機制尚未完全明了,SOCS3是由瘦素誘導的潛在瘦素抵抗因子,它對瘦素信號通路的抑制作用及其自身的調控因素目前還有待于進一步闡明;2)有氧運動是否可以增加肥胖癥患者LP-Rb水平,從而使其與體內的瘦素結合,激活受體后通路,增加熱量消耗,達到減肥的目的;3)運動和膳食干預是否會對SOCS3產生影響,其具體機制是什么。

基于以上研究背景,本研究通過對肥胖伴有瘦素抵抗現(xiàn)象的大鼠進行有氧運動及降低熱量攝入的膳食干預,觀察其下丘腦中SOCS3、LP-Rb及信號轉換和轉錄激活因子3(STAT 3)磷酸化水平這幾項指標的變化,探討運動、膳食干預是否能夠通過SOCS3變化影響下丘腦LP-Rb及受體后主要信號轉導通路JAK2-STAT 3活化水平,繼而改善瘦素抵抗現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

健康、雄性純系7周齡 Sprague-Dawley(SD)大鼠130只,體重206～257g,購于上海西普爾—必凱實驗動物有限公司。參照隨機數(shù)字表分組,空白對照組(C組,n=10);高脂膳食模型組(H組,n=120)。分籠飼養(yǎng),每籠5只。室溫22℃±2℃,相對濕度55.6%±4%。每日光照黑暗時間各為12 h,自由飲水、活動,不限飼料量,每天早晚2次添加飼料,保證飼料供應。

采用不同喂養(yǎng)方式8周后,篩選高脂膳食模型組體重排序前1/3的40只大鼠,與對照組比較體重、血清瘦素水平及判斷肥胖程度的相對指標——Lees指數(shù)[29]。建模成功后,高脂膳食建模組大鼠重新隨機分組為高脂膳食對照組(H16)、高脂膳食運動組(HHE)、普通膳食運動組(HNE)、普通膳食組(HN)及原有的空白對照組(N16)。

1.2 實驗動物喂養(yǎng)

標準嚙齒類動物飼料適應性喂養(yǎng)7天,然后,分別給予對照組和建模組不同飼料喂養(yǎng),連續(xù)喂養(yǎng)8周。普通標準嚙齒類飼料由中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學動物實驗中心提供,高脂飼料由中國科學院上海實驗動物中心上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。高脂飼料配方在參考孫志等人方法的基礎上改進[7]。在普通飼料中添加10%豬油,15%蔗糖,0.2%膽固醇,0.2%蛋黃及少量維生素和礦物質。高脂飼料低溫保存,喂養(yǎng)前復溫24 h后給食。

1.3 運動干預方案

根據(jù)運動減肥中運動強度應為中、小強度有氧運動的原則,動物運動干預采用段式 PT-98型動物跑臺進行訓練,運動訓練方案參考Bedford動物運動負荷方案等文獻制定[11]。為了使大鼠逐漸適應運動強度,運動開始時連續(xù)運動9天,第1天跑速10 m/min,持續(xù)時間20 min,以后隔日增加強度2 m/min,持續(xù)時間增加10 min,第9天起跑速達18 m/min,持續(xù)時間達60 min,5%的坡度。在第5～8周將跑速調節(jié)到20 m/min,其余和前4周相同,每周運動5天,共運動8周。在運動實施前預實驗中分別檢測了大鼠安靜及運動后血乳酸值,分別為2.3±0.4 mmol/L及3.7±0.6 mmol/L,提示,訓練屬于中等強度有氧運動。

作者單位:1.南京郵電大學體育部體育科學研究所,江蘇南京210046;2.上海體育學院運動科學學院,上海200438;3.安徽師范大學生命科學院,安徽蕪湖241000

1.4 取材

分別于實驗第8周和第16周末,運動組運動48 h后,通過大鼠眼球后內眥靜脈采血測試部分血液指標。第16周采血后,運動組恢復運動1天,距最后一次運動48 h后進行取材。所有大鼠禁食12 h,用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔內注射麻醉成功后,將大鼠仰臥固定于自制的手術臺上,打開腹腔與胸腔,于下腔靜脈取血約8 ml左右,靜置待血清析出,3 000 rpm離心5 min分離血清,于-20℃冰箱保存待檢。

取血后,即刻將大鼠斷頭,以組織剪沿頭部正中矢狀軸剪開皮毛、顱骨,再以小號咬骨鉗咬斷、剔除顱骨,暴露腦組織。在4℃冰面上,輕輕翻轉腦組織,分離腦區(qū),以灰結節(jié)和視交叉之間的中心點為中心確定下丘腦組織(前界為視交叉前緣,后界為乳頭體后緣,兩側為顳側溝,寬約4 mm,深約2 mm,長約4 mm),取出下丘腦組織,迅速投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標測定方法

1.5.1 體重、Lees指數(shù)測定

每周周二統(tǒng)一時間由專人稱量大鼠體重、測量鼻尖到肛門的長度,計算Lees指數(shù)。

1.5.2 血清瘦素水平測定

血清瘦素水平采用酶聯(lián)免疫吸附法測定(ELISA)。試劑盒由美國R&D公司提供,MK3型酶標儀為芬蘭 Thermo公司產。

1.5.3 下丘腦 SOCS3、LP-Rb、STAT3、p-STAT3蛋白免疫印跡測定

采用Western blot法檢測大鼠下丘腦中SOCS3水平,以 GAPDH為內參對照。1)組織總蛋白提取:取凍融下丘腦約100 mg,加含抑制劑預冷的蛋白質抽提試劑,每次30 s低速勻漿,至組織完全裂解,裂解液于預冷的離心機中12 000 rpm離心15 min,取上清液。2)蛋白濃度測定:以BCA蛋白定量法測定上清液中蛋白濃度。3)SDS-PAGE電泳、轉膜:將蛋白樣品加入3×上樣緩沖液,煮沸3～5 min后冰浴5 min,經 SDS-PAGE電泳后,轉移至 PVDF膜(恒流200 mA,h)。4)膜的封閉和抗體孵育:用 TBST洗PDF膜3次后,置封閉液(含5%BSA+TBST)中于水平搖床上緩慢搖動,室溫下封閉1 h封閉膜上非特異結合;封閉后分別加入一級抗體孵育4℃過夜(兔抗大鼠SOCS3抗體1∶1 000,博奧森生物技術有限公司;兔抗大鼠LP-Rb抗體1∶1 000,博士德生物工程有限公司;兔抗大鼠STAT 3抗體1∶1 000,博士德生物工程有限公司;兔抗大鼠 Phospho-STAT 3(Tyr705)抗體1∶500,Bioworld Technology公司)和 GAPDH一抗;TBST洗膜后加入 HRP標記的二級抗體(1∶3 000)以結合一級抗體。5)蛋白檢測:PVDF膜蛋白面向上,反應液鋪于膜上室溫孵育3 min;膜夾于兩塑料薄膜中,于暗室中壓片,以 X光膠片曝光,顯影定影后膠片備存;掃描圖片,以 ImageJ分析軟件進行分析比較。電泳、轉移裝置為美國BIO-RAD公司產。

1.5.4 下丘腦SOCS3 mRNA表達測定

采用實時熒光定量 PCR法測定大鼠下丘腦 SOCS3 mRNA表達。Realtime PCR引物由ABI公司引物設計軟件Primer 5.0設計,以 GADPH為內參,引物由上?？党缮锕竞铣?。

1)總 RNA抽提:每約50 mg組織樣品中,加入約1 ml TRIZOL試劑后勻漿。每1 ml勻漿樣品中加入約0.2 ml氯仿,于4℃12 000 rpm離心15 min,取上層水相至新離心管,加入 0.5 ml異丙醇混勻,15℃～30℃孵育10 min后,于4℃12 000 rpm離心10 min;棄上清,加入75%乙醇1 ml洗滌,7 500 rpm離心5 min;空氣中自然干燥RNA沉淀約5～10 min,加入DEPC處理水。2)逆轉錄合成 CDNA:總 ENA為2μg,反應體系總體積為20μg。3)PCR反應:PCR反應溶液于 Realtime-PCR儀上進行 PCR反應,95℃,5 min;35個 PCR循環(huán)(95℃,10 s;58℃,15 s;72℃,20 s;81℃,5 s)。擴增反應結束后,繼續(xù)從72℃緩慢加熱至99℃以便建立PCR產物熔解曲線。PCR儀在擴增過程中自動匯總采集熒光信號,并轉換成待測樣品的Ct值(循環(huán)閾值)。4)反應產物檢測及定量分析:根據(jù)梯度稀釋DNA標準曲線、待測樣品Ct值,算出該樣品的起始拷貝數(shù)。各目的基因、管家基因濃度直接由機器讀出,每個樣品目的基因濃度除以其管家基因濃度,即為此基因校正后的相對含量。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 運動、膳食干預后各組大鼠體重、Lees指數(shù)、血清瘦素的變化

干預措施后,相對于 H16組,各干預組大鼠體重、Lees指數(shù)指標都具顯著性差異(P＜0.01)。單獨膳食、單獨運動及兩者聯(lián)合這3種干預措施中,可以看出運動聯(lián)合膳食干預措施效果較好。HNE組大鼠在這兩項指標中都顯著性低于 HHE組或 HN組(P＜0.05)。HNE組瘦素水平顯著性低于 H16組、HHE組及 HN組 (P＜0.01)。但各干預組瘦素水平依然顯著高于N16組(P＜0.05;表1)。

表1 本研究干預措施后各組大鼠體重、Lees指數(shù)、血清Leptin變化一覽表Table 1 Weight,Lees,Serum Leptin of Each G roup Rats after Interventions(±SD)

表1 本研究干預措施后各組大鼠體重、Lees指數(shù)、血清Leptin變化一覽表Table 1 Weight,Lees,Serum Leptin of Each G roup Rats after Interventions(±SD)

注:各組與N16組比較(each group compared with N16),## P＜0.01,# P＜0.05;各干預組與 H16比較(intervention group compared with H16),＊ ＊P＜0.01,＊ P＜0.05;HHE、HN組與 HNE組比較(HHE,HN compared with HNE),@@P＜0.01,@P＜0.05;下同。

n 體重(Weight,g) Lees指數(shù)(Index) Leptin(ng/ml)HNE 10 539.75±29.65＊＊ 312.64±6.84＊＊ 2.57±0.60＊＊#HHE 10 560.60±23.50##＊＊ 323.28±11.17#＊＊@ 3.49±0.68##＊@@HN 10 570.50±26.96##＊＊@@ 321.93±9.72#＊＊@ 3.74±0.77##@@H16 10 670.05±17.19## 336.76±6.71## 4.08±0.70##N16 10 522.37±22.98 312.47±10.13 1.86±0.40

2.2 大鼠下丘腦LP-Rb蛋白水平

8周高脂膳食后,H16組大鼠下丘腦LP-Rb水平顯著低于 N16組(P＜0.05)。而與 H16組比較,HNE及HHE組較之有顯著性提高(圖1、表2)。

圖1 大鼠下丘腦LP-Rb蛋白水平檢測結果示意圖Figure 1. LP-Rb Protein Expression in Hypothalamus of Rats

圖2 干預措施后大鼠血清瘦素與下丘腦LP-Rb水平相關趨勢示意圖Figure 2. Correlation between Serum Leption and LP-Rb in Hypothalamus of Rats after Interventions

圖3 大鼠下丘腦p-STAT3、STAT3蛋白水平檢測示意圖Figure 3. p-STAT3,STAT3 Protein Expression in Hypothalamus of Rats

表2 本研究干預措施后各組大鼠下丘腦LP-Rb/GAPDH比較一覽表Table 2 LP-Rb/GAPDH in Hypothalamus of Each G roup Rats after Interventions(±SD)

表2 本研究干預措施后各組大鼠下丘腦LP-Rb/GAPDH比較一覽表Table 2 LP-Rb/GAPDH in Hypothalamus of Each G roup Rats after Interventions(±SD)

n LP-Rb/GAPDH HNE 10 0.40±0.09＊＊HHE 10 0.32±0.09＊@HN 10 0.31±0.06@H16 10 0.24±0.08#N16 10 0.33±0.09

2.3 干預措施后大鼠血清瘦素與下丘腦LP-Rb相關性

如圖2所示,8周運動、膳食干預措施后大鼠血清瘦素與下丘腦LP-Rb呈微弱負相關性,R=-0.286(P＜0.05)。

2.4 大鼠下丘腦STAT3蛋白及其磷酸化水平檢測結果

8周的高脂膳食并未造成H16組與N16組大鼠下丘腦STAT3、p-STAT3及p-STAT3/STAT3的差異 ,而運動、膳食干預則提高了 HNE組與 HHE組的p-STAT3及p-STAT3/STAT3水平,較 H16組有顯著性差異(P＜0.05;圖3、表3)。

表3 本研究干預措施后各組大鼠下丘腦p-STAT3/STAT3水平檢測結果一覽表Table 3 p-STAT3/STAT3 Protein Expression in Hypothalamus of Each R at after Interventions(±SD)

表3 本研究干預措施后各組大鼠下丘腦p-STAT3/STAT3水平檢測結果一覽表Table 3 p-STAT3/STAT3 Protein Expression in Hypothalamus of Each R at after Interventions(±SD)

n STAT3/GAPDH p-STAT3/GAPDH p-STAT3/STAT3 HNE 10 0.57±0.05 0.44±0.18＊＊ 0.78±0.35＊HHE 10 0.54±0.11 0.39±0.17＊ 0.72±0.28＊HN 10 0.53±0.11 0.29±0.09 0.53±0.12 H16 10 0.49±0.09 0.17±0.08 0.36±0.21 N16 10 0.55±0.08 0.32±0.15 0.57±0.22

2.5 大鼠下丘腦總RNA提取完整性檢測結果

大鼠下丘腦總RNA提取經瓊脂糖凝膠電泳后顯示:總RNA提取完整,無污染,無拖尾現(xiàn)象,18 s及 28 s核糖體RNA顯示清晰。紫外分光光度計測其230 nm、260 nm和280 nm處的紫外吸光值(A),以 A260/A230、A260/A280用于濃度和純度分析,所有 RNA樣品A260/A230均在 1.8～2.1之間,A260/A280均大于2.0(圖4)。

圖4 大鼠下丘腦總RNA提取質檢電泳圖Figure 4. Electropherogram of Total RNA in Hypothalamus of Rats

2.6 大鼠下丘腦SOCS3 mRNA水平的表達

8周干預措施后,各組大鼠下丘腦SOCS3 mRNA表達量無顯著性差異(P＞0.05;表4)。

表4 干預措施后大鼠下丘腦SOCS3 mRNA表達量比較一覽表T able 4 Expression of SOCS3 mRNA in Hypothalamus of Rats after Interventions(±SD)

表4 干預措施后大鼠下丘腦SOCS3 mRNA表達量比較一覽表T able 4 Expression of SOCS3 mRNA in Hypothalamus of Rats after Interventions(±SD)

n SOCS3表達相對值HNE 10 3.38E-02±1.28E-02 HHE 10 4.28E-02±1.28E-02 HN 10 4.26E-02±2.00E-02 H16 10 4.73E-02±1.45E-02 N16 10 3.66E-02±1.26E-02

2.7 大鼠下丘腦SOCS3蛋白水平

8周的高脂膳食并未造成H16組與N16組大鼠下丘腦SOCS3蛋白水平顯著性的差異。而8周的運動聯(lián)合膳食干預或單獨運動干預措施卻能明顯降低 HNE組及HHE組大鼠下丘腦 SOCS3蛋白水平,且較 H16組有顯著性差異 (P＜0.05),其中,HNE組顯著低于N16組(P＜0.05)。而 HHE及 HN組顯著性高于 HNE組(P＜0.01;圖5、表5)。

圖5 大鼠下丘腦SOCS3蛋白水平示意圖Figure5. SOCS3 Protein Expression in Hypothalamus of Rats

表5 本研究干預措施后大鼠下丘腦SOCS3/GAPDH檢測結果一覽表Table 5 SOCS3/GAPDH in Hypothalamus of Each G roup Rats after Interventions(±SD)

表5 本研究干預措施后大鼠下丘腦SOCS3/GAPDH檢測結果一覽表Table 5 SOCS3/GAPDH in Hypothalamus of Each G roup Rats after Interventions(±SD)

n SOCS3/GAPDH HNE 10 0.26±0.06＊＊##HHE 10 0.41±0.14＊@@HN 10 0.44±0.11@@H16 10 0.52±0.12 N16 10 0.50±0.12

2.8 大鼠下丘腦SOCS3蛋白水平與血清瘦素濃度相關性

8周干預措施后,大鼠下丘腦 SOCS3蛋白水平與血清瘦素濃度呈低度相關,相關系數(shù) R=0.338(P＜0.05;圖6)。

圖6 干預措施后大鼠下丘腦SOCS3水平與血清瘦素濃度相關趨勢示意圖Figure 6. Correlation between Serum Leption and SOCS3 in Hypothalamus of Rats after Interventions

3 討論與分析

3.1 運動、膳食干預對大鼠血清瘦素及下丘腦LP-Rb蛋白水平的影響及作用機制

瘦素必須與其受體結合后才能激活其受體后信號通路,從而發(fā)揮降低食欲、增加能耗、調節(jié)體重的作用。在眾多的瘦素受體中只有長型受體LP-Rb具有信號傳導功能,為功能性受體。下丘腦是LP-Rb重要分布區(qū)域,它與瘦素結合后,主要通過JAK2-STAT3信號途徑發(fā)揮作用。因此,本研究以LP-Rb做為實驗指標之一。雖然,外周多種組織都有瘦素受體的表達,但下丘腦被認為是最重要的代謝和能量平衡的調節(jié)中樞[3]。大多數(shù)肥胖者體內存在高瘦素水平,即瘦素抵抗現(xiàn)象,瘦素抵抗又是肥胖癥的一個潛在誘發(fā)因素,兩者相互作用形成惡性循環(huán),導致體重增加[40]。高瘦素血癥、瘦素受體表達下調及受體后缺陷通常被認為是造成瘦素抵抗的眾多原因之一。

運動、膳食控制做為肥胖癥等代謝性疾病的主要調控手段,可以對機體內分泌功能、能量代謝、基因的表達產生多重影響[14]。而瘦素在中樞的主要生理功能之一是調節(jié)食欲、控制能量平衡,因此,本實驗有理由假設運動、膳食干預會對瘦素、瘦素受體及受體后通路產生一定的影響。

運動對瘦素的影響受到很多因素控制,如運動方式、運動負荷等。通常認為,一次短時間的運動對瘦素不會產生影響,即便有影響也可能是由于晝夜節(jié)律或自身血液濃縮造成的,而單次長時間(＞60 min)運動使瘦素水平的下降與機體能量負平衡有關[4]。除2型糖尿病病人外,有研究認為,小于12周的運動對瘦素沒有影響,而大于12周的運動對瘦素影響結果并不一致[27]。本實驗目的是為了給肥胖人群進行科學減肥提供基礎理論依據(jù),因此,運動干預方式采用了中等強度的有氧運動。國內學者對大鼠進行6周有氧跑臺運動訓練,結果顯示,有氧運動可以降低血清瘦素水平,且具有時相性[1]。張纓等在實驗中則得出了相反的結論,她發(fā)現(xiàn),6周的自由泳訓練可以顯著升高大鼠血清瘦素濃度[9]。而Baek在研究膳食干預對瘦素影響的實驗中發(fā)現(xiàn),在保證基本熱量需要的情況下,4周后實驗組進食量降低30%,與實驗前比較其血清瘦素水平下降27%,且體重也有降低(P＜0.05),對照組瘦素及體重都呈上升水平(P＜0.05)[10]。

本研究結果提示,運動聯(lián)合膳食干預改善高瘦素血癥較單獨運動或飲食干預效果明顯,而血清瘦素對運動干預較膳食干預敏感。至于本實驗中單獨膳食干預未能顯著性降低大鼠血清瘦素水平,而運動干預效果次于聯(lián)合措施,可能是由于雖然能量消耗是引起瘦素下降的前提條件之一,但瘦素對單純的能量消耗或熱量攝入不敏感,只有其兩者之間的平衡才對瘦素有影響[24]。這與 Solomon的研究結果是一致的,他將23名老年肥胖人群分為2組,一組為正常飲食,另一組為能量攝入限制飲食,2組受試者都以75%的最大耗氧量,每次60 min,每周5次,進行為期12周的有氧運動。結果2組受試者血清瘦素水平都有所下降,但運動結合能量攝入限制組更具有顯著性[41]。同樣,118名具有糖尿病和心血管高危因素的男性在經過一年每周3次的有氧運動和限制飽和脂肪酸及膽固醇的膳食干預后,單純運動組血清瘦素下降了5%,單純膳食干預組下降10%,而運動結合膳食干預組下降了24%[37]。運動、膳食干預通常會對肥胖人群體成分、胰島素水平產生影響,而這兩者又是通過“脂肪—胰島素軸”相互聯(lián)系的,這可能是導致機體瘦素水平變化的原因。

瘦素必須在中樞或外周與LP-R結合后,通過信號轉導調節(jié)神經肽 Y(NPY)、阿黑皮素原(POMC)等蛋白基因表達和活性,才能發(fā)揮其調節(jié)攝食、能量平衡、代謝、生殖等生理作用。將小劑量的瘦素注入第三腦室,可以明顯降低大鼠體重,表明瘦素主要通過中樞神經系統(tǒng)(CNS)發(fā)揮作用[15]。在CNS中下丘腦是調節(jié)機體能量平衡最重要的部位,也是LP-R最主要的分布區(qū)域[16]。而LP-Rb是下丘腦中惟一能進行信號轉導的功能性受體。

肥胖者大多伴有瘦素抵抗,盡管其形成原因很多,但LP-R及受體后缺陷是其重要的發(fā)生機制之一。向膳食誘導的肥胖大鼠中樞注入瘦素,并無任何療效,證實了這一點[34]。本實驗中,經過16周高脂喂養(yǎng)后,H16組大鼠下丘腦中LP-Rb水平顯著低于空白對照組(N16),提示,肥胖可以導致下丘腦LP-Rb蛋白水平明顯降低,而這必然導致瘦素與其結合的數(shù)量減少,最終使瘦素不能實現(xiàn)在中樞的生物學效應,這可能是瘦素抵抗發(fā)生的機制之一。

目前,關于運動、膳食干預對LP-R影響的研究比較少,特別是對中樞LP-Rb的研究。僅有少量實驗證實耐力訓練可以上調飲食性肥胖大鼠脂肪細胞LP-R的基因表達,而其中以運動結合飲食控制效果最為顯著[5]。國內學者叢琳等也發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠經過12周中、小強度的運動后,骨骼肌內LP-R的mRNA及蛋白水平都有顯著升高[2]。但也有不同的實驗結果,運動8周后,無論高脂、高碳水化合物或普通飲食,大鼠肝臟 a、b、e型LP-R基因表達水平都顯著下降[48]。本實驗中,與高脂對照組(H16)比較,單獨的膳食干預雖引起肥胖大鼠下丘腦LP-Rb蛋白含量的上升,但未有顯著性差異,單獨運動干預引起了LP-Rb含量顯著上升(P＜0.05),而兩者的聯(lián)合干預使LP-Rb水平上升幅度異常顯著(P＜0.01),提示,運動結合膳食干預增加LP-Rb的表達可能是改善瘦素抵抗的機制之一。有觀點認為,LP-R與機體的BMI呈負相關,且瘦素與其受體的結合率隨著體重的下降而上升[46]。前期實驗已證實,干預措施后,HNE組較HHE、HN組無論在體重或體脂下降都最為顯著。因而可以推測,運動、膳食干預或許通過改變體重及體脂的含量而間接的影響LP-R水平。而劉正娟在其博士論文中認為,高脂誘導的肥胖大鼠體內瘦素與LP-Ra、LP-Rb之間存在負反饋調節(jié),瘦素抵抗機體中的高瘦素可能會抑制其受體的表達[6]。本實驗結果中,雖然在干預措施后,與 H16組比較,血清瘦素有下降變化趨勢,下丘腦中LPRb則有上升趨勢,但大鼠血清瘦素與下丘腦LP-Rb之間只有非常弱的負相關作用。這可能是由于血清瘦素必須要透過血腦屏障才能到達中樞與其受體結合發(fā)揮作用,因而可能LP-R與中樞的瘦素水平更為密切。因此,運動、膳食干預對下丘腦LP-Rb影響的具體機制尚需進一步研究。

3.2 運動、膳食干預對大鼠下丘腦STAT3及其磷酸化蛋白水平的影響及作用機制

瘦素與其受體結合后需要完整的信號通路才能發(fā)揮其生物效應,已經確認的LP-R信號通路有JAK-STAT通路、分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷酸肌醇 3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3-K)通路,而JAK2-STAT3目前被認為是瘦素最主要的信號轉導途徑[31,45]。

瘦素信號通過LP-Rb進行調節(jié),LP-R屬于Ⅰ型細胞因子受體,缺乏自身的酪氨酸激酶的活性。當瘦素與其受體結合后,使JAK2上的酪氨酸激酶激活,這樣又導致受體胞內的某些酪氨酸殘基磷酸化,從而為STAT3提供了結合位點。被激活的磷酸化STAT3形成二聚體,從核膜轉入核內,在核內調節(jié)不同基因的轉錄[21]。在若干STAT蛋白中,瘦素能特異性增加STAT3的磷酸化水平和STAT3的DNA的結合率[31],STAT3信號途徑障礙可以導致肥胖的發(fā)生。飲食誘導的肥胖大鼠下丘腦中除了發(fā)現(xiàn)其LP-R蛋白表達降低,還發(fā)現(xiàn)了瘦素信號轉導中STAT3表達水平的下降[18]。提示,下丘腦信號通路中STAT3的減弱可能與高脂誘導的肥胖機體發(fā)生瘦素抵抗有關。有研究已經發(fā)現(xiàn),高脂飲食誘導的瘦素抵抗大鼠下丘腦弓狀核(ARC)內伴隨著STAT3磷酸化水平的不足[33]。磷酸化的STAT3相當于LP-Rb的第二信使,在下丘腦中廣泛表達[23]。與此相似的結果還有,STAT3神經元敲除的大鼠出現(xiàn)肥胖和瘦素抵抗現(xiàn)象[17]。

本實驗結果中,與 N16組比較,H16組大鼠下丘腦中STAT3和p-STAT3水平雖有所下降,但沒有顯著性差異。提示,高脂誘導肥胖大鼠的瘦素抵抗并不一定存在下丘腦中STAT3蛋白及其磷酸化水平的降低,或者說,LP-Rb-STAT3信號通路并不一定與瘦素生理功能相平行。當然,此結果也有可能與干預周期不夠長,不足以引起p-STAT3水平顯著性變化有關。8周干預措施后,各組大鼠下丘腦中的STAT3的總蛋白雖沒有顯著性的差異,而其活性狀態(tài)的 705位點的 p-STAT3水平,與 H16組比較,HNE、HHE組有顯著性的上升,其中,HNE組 P＜0.01,HHE組 P＜0.05。提示,運動、膳食干預未顯著影響LP-R后信號通路中 STAT3蛋白水平,但運動能顯著提高其磷酸化水平,其中以運動結合膳食干預影響為最,說明運動結合膳食干預可能對瘦素信號通路JAK2-STAT3存在正性調節(jié)作用。這與 Flores的觀點相符,他認為運動能增加下丘腦一些蛋白的磷酸化水平[20]。Patterson將高脂膳食誘導的肥胖大鼠分為安靜對照組、3周運動后停訓10周組及連續(xù)13周運動組。在實驗開始3周后,以5 mg/kg瘦素對大鼠進行腹腔注射,結果運動組大鼠下丘腦弓狀核p-STAT3水平高于對照組23%,同時增加的還有腹內側核和背內側核的LP-R。至13周實驗結束時,僅 13周運動組 p-STAT3水平高于對照組32%[35]。而在人體實驗中,Trenerry在對大強度抗阻訓練后老年人肌肉進行活檢發(fā)現(xiàn),其骨骼肌內的STAT3水平增加了23倍,而年輕人也增加了5倍,且同時升高的還有 IL-6和 SOCS3 mRNA水平,但 SOCS3胞內蛋白水平是受到抑制的[44]。在僅有少數(shù)膳食干預對 STAT3影響的研究中,有實驗報道,膳食誘導的肥胖 F344-BN雄性大鼠在給予30天的能量攝入限制后(60%標準嚙齒類動物飼料熱能),下丘腦中p-STAT3水平增加了85%,而對照組增加了45%,同時增加的還有兩組的LP-Rb基因表達和蛋白水平[47]。

目前,關于運動、膳食干預對瘦素抵抗機體下丘腦中STAT3影響機制的研究較少,干預措施后p-STAT3水平上升的原因還不清楚。有可能與瘦素抵抗改善后機體對瘦素敏感性增加及LP-Rb水平上升有關,因為LP-Rb可以通過與JAK2的結合催化STAT3磷酸化表達,JAK2結合到受體與配體形成的二聚體后激活受體,隨后使與LP-R結合的STAT3磷酸化。因此,LP-Rb水平的增加必然使其與JAK2結合和自身磷酸化數(shù)量上升,從而最終增加p-STAT3水平。本實驗結果中,HNE組LP-Rb蛋白含量上升最多,正符合了此觀點。

3.3 運動、膳食干預對大鼠下丘腦 SOCS3 mRNA及蛋白水平的影響及其在中樞瘦素抵抗中的作用機制

即使有完整的JAK2-STAT3的信號通路,下丘腦神經元依然可以發(fā)生瘦素抵抗,SOCS3和其他一些瘦素信號的負性調節(jié)因子可能在中樞瘦素抵抗中起到關鍵性的作用[38]。

通常認為,瘦素的信號途徑JAK2-STAT3是受到SOCS3的負反饋調控的。雖然過度表達的 SOCS3可以在哺乳動物的細胞株內弱化JAK-STAT信號,但瘦素在下丘腦可誘導SOCS3的表達及激活NPY和 POMC神經元內SOCS3,因此,SOCS3增加通常被認為是瘦素抵抗的標志[12]。SOCS3可以通過多種機制弱化LP-R后信號:通過SH2位點SOCS3可以競爭性與磷酸化的LP-Rb結合而抑制STAT3的激活,也可以通過其 N末端激酶抑制區(qū)抑制JAK酪氨酸激酶活性,或者通過C端 SOCS盒募集泛素轉移酶系統(tǒng)調節(jié)LP-Rb與JAK復合物的降解,從而阻信號的轉導[13]。

作為瘦素信號通路的一個潛在抑制因子,人們推測SOCS3表達的變化或許是肥胖人群發(fā)生瘦素抵抗的機制之一。Howard發(fā)現(xiàn),SOCS3雜合子缺乏的大鼠與其野生型相比,在外源性瘦素作用下,其下丘腦瘦素受體后信號通路顯著上升,體重下降,抗飲食誘導肥胖和代謝綜合征能力也顯著提高[25]。在高脂飲食誘導的瘦素抵抗肥胖大鼠下丘腦弓狀核內,人們也發(fā)現(xiàn)其SOCS3 mRNA水平較對照組顯著上升,而LP-Rb和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)mRNA都未有顯著性變化。ARC中增加50%的SOCS3就可以顯著降低高脂飲食下大鼠LP-Rb-STAT3的信號通路及增加大鼠體重[33]。國內也有報道,8周高脂飲食喂養(yǎng)后,大鼠下丘腦中 SOCS3 mRNA水平顯著上升,并且與升高的血清瘦素呈正相關[8]。而本實驗中,經過16周高脂喂養(yǎng)后,大鼠下丘腦無論 SOCS3在mRNA或蛋白水平,H16組與N16組都沒有顯著性差異,這與 Fam的研究結果一致[19]。提示,高脂膳食導致的瘦素抵抗并不一定必然的伴有中樞 SOCS3 mRNA或蛋白水平的升高。

目前,已經確定的是 SOCS3是瘦素抵抗的一個負性調節(jié)因子,但很少有關于運動干預對 SOCS3影響的研究報道,而已有的研究結果中也并無統(tǒng)一的結論。4周的高脂膳食能夠導致大鼠出現(xiàn)瘦素抵抗及骨骼肌中的SOCS3 mRNA水平增加,而耐力運動可以通過加強 FFA的氧化改善瘦素抵抗現(xiàn)象,但并不降低 SOCS3的水平[43]。相反的報道有,大鼠經過12周速度漸增的跑臺運動誘導IL-6表達增加而使骨骼肌內的 SOCS3水平上升及大鼠后肢經過一天懸垂后,比目魚肌內的 SOCS3 mRNA水平顯著降低[42]。由此可見,不同的運動方式、運動時間及運動量對機體SOCS3水平產生不同的影響效果,且目前大多數(shù)研究集中于骨骼肌 SOCS3的變化,而攝食和能量平衡的調節(jié)中樞—下丘腦中 SOCS3水平卻鮮有報道。關于熱能攝入控制對 SOCS3的影響研究也鮮有報道,Peralta提出胰島素抵抗合并中樞瘦素抵抗老年大鼠下丘腦中升高的SOCS3 mRNA水平,在實施3個月飲食控制后得到了改善[36]。

為了確定膳食及運動干預對中樞 SOCS3有無影響,若有影響SOCS3的變化是在轉錄還是翻譯環(huán)節(jié),本實驗同時測了SOCS3的 mRNA及蛋白水平。8周干預措施后,各組之間的 SOCS3 mRNA未出現(xiàn)顯著性差異,H16組與N16組蛋白水平也無差異,HNE、HHE組 SOCS3 mRNA雖無變化,但蛋白水平較 H16組顯著性下降。調控基因表達的層次很多,轉錄或翻譯只是其中的一個環(huán)節(jié)。雖然在一定程度上mRNA水平與其蛋白水平有著必然的聯(lián)系,但是兩者的檢測水平不能混為一談,特定基因的mRNA豐度不是必然與其翻譯產物——蛋白的水平呈線性關系。國外有學者通過對密碼子的進一步研究,提出單純從mRNA水平推測蛋白的表達是不夠的,蛋白的表達比mRNA水平更有價值[22]。HNE、HHE組大鼠mRNA和蛋白水平變化的不同步性,正體現(xiàn)了轉錄和翻譯過程不是必然的線性關系。此外,蛋白質水平的降低也可能與干預措施導致其降解過多有關。

HNE、HHE組大鼠 SOCS3蛋白水平在干預措施后較 H16組顯著性下降,提示,單獨運動或運動與膳食的聯(lián)合干預措施能顯著降低大鼠SOCS3水平,而SOCS3對運動的調控相對于膳食更為敏感。SOCS3是瘦素抵抗的負性調節(jié)因子,它可由瘦素特異性誘導表達,又通過抑制STAT3的磷酸化水平負反饋調節(jié)瘦素受體后信號通路。本實驗中,大鼠下丘腦SOCS3蛋白水平與血清瘦素呈低度相關,提示,血清瘦素含量可能是導致 SOCS3變化的因素之一。根據(jù)前期研究結果,作者推測,干預措施造成SOCS3改變的機制,可能是由于運動、膳食控制后影響大鼠體重、體脂的變化,從而導致脂源性激素瘦素發(fā)生量變,進而使中樞SOCS3水平發(fā)生相應的改變。

JAK2-STAT3是瘦素在中樞的最主要信號通路,當配體結合到LP-Rb后,導致了JAK2的激活和LP-Rb的Tyr985和 Tyr1138磷酸化。磷酸化的 Tyr985與酪氨酸磷酸化酶(SHP-2)結合能夠調節(jié)上游的細胞外信號調節(jié)激酶(EPK)活性、c-fos轉錄及抑制 STAT3活性。而1 138位的酪氨酸磷酸化募集了包含SH2結構域的轉錄因子STAT3,使其磷酸化及核轉移。STAT3進入核內后即啟動基因的轉錄,其中也包括瘦素信號的負反饋調節(jié)因子SOCS3,因此,p-STAT3被認為是中樞瘦素信號轉導的特征性參數(shù)之一[49]。目前研究認為,SOCS3可以利用其SH2結構域與 STAT相似,競爭性結合LP-Rb的 Tyr985結合位點,阻止 STAT3的活化,抑制瘦素受體后信號轉導[26]。此外,SOCS3還可以直接與JAK2結合抑制其酪氨酸激酶活性,進而抑制瘦素受體后JAK-STAT信號通路[12],提示,SOCS3可能通過JAK2-STAT3通路阻斷瘦素受體后信號通路。

中樞瘦素抵抗發(fā)生過程中,除了JAK2-STAT3通路、SOCS3外還有很多其他參與的信號通路及負性調節(jié)因子。瘦素信號的 PI3 K-PDE3B-cAMP通路在瘦素抵抗中起著重要作用,有實驗證實了在飲食誘導的肥胖 FVB/N小鼠中,是下丘腦中 PI3 K通路缺陷而非JAK-STAT通路導致了其中樞瘦素抵抗[32]。蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(PTP1B)是LP-R信號的另外一個負性調節(jié)因子,在下丘腦LP-Rb表達的地方同樣有表達[50]。PTP1B敲除大鼠對飲食誘導的肥胖有抵抗作用,且對瘦素高度敏感,提示,其在下丘腦瘦素信號中有著顯著作用[28]。因此,可能PTP1B與SOCS3之間的平衡和相互作用對正常的瘦素信號起著關鍵性的作用,同樣也決定著中樞瘦素抵抗的發(fā)生。所以,若有條件可以選用 PTP1B敲除及SOCS3阻滯劑進行進一步的研究,將有利于瘦素抵抗的機制的探明。

因此,高脂飲食引起的肥胖與瘦素抵抗可能是包括SOCS3在內的多個抑制因子共同作用,多個環(huán)節(jié)相互關聯(lián)的結果。要徹底了解運動、膳食干預改善瘦素抵抗和肥胖的生物學基礎,還需更多深入、復雜的研究工作。

4 結論

1.高脂膳食可以導致大鼠血清瘦素上升,下丘腦中LP-Rb蛋白水平下降,這可能是瘦素抵抗發(fā)生的機制之一。

2.運動聯(lián)合膳食干預較單獨的運動或膳食干預可以明顯改善大鼠中樞瘦素抵抗,其機制可能與下列因素有關:1)降低血清瘦素水平,上調下丘腦中LP-Rb受體蛋白水平;2)增加下丘腦中JAK2-STAT3通路中 STAT3磷酸化水平;3)降低下丘腦中SOCS3蛋白水平。

3.高脂膳食導致的瘦素抵抗并不必然伴有下丘腦中SOCS3 mRNA和蛋白水平的升高,但運動及運動聯(lián)合膳食干預卻可以通過下調SOCS3蛋白水平改善瘦素抵抗,在預防和治療肥胖癥中可能起到一定的作用。

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Mechanism of Exercise and Diet Interventions on Central Posterior Receptor Signaling of Leptin Resistance Rats

TAN Yan1,CHEN Wen-he2,GUO Li2,SUN Qing-yan3

目的:觀察運動、膳食干預對具有瘦素抵抗現(xiàn)象肥胖大鼠中樞受體后信號通路的影響,探討SOCS3在瘦素抵抗發(fā)生及改善過程中的作用。方法:雄性SD大鼠130只,隨機分為對照組10只,建模組120只,分別給予普通標準嚙齒類動物飼料和高脂飼料喂養(yǎng)8周。篩選出建模組體重排序前1/3大鼠,測量其血清瘦素水平,隨機分為高脂膳食對照組(H16)、高脂膳食運動組(HHE)、普通膳食運動組(HNE)、普通膳食組(HN),原有的空白對照組為N16組,各組大鼠分別給予中等強度的跑臺運動干預或膳食干預8周。采用 ELISA法測量血清瘦素水平;Western blot法檢測下丘腦中LP-Rb、STAT 3、p-STAT 3及SOCS3蛋白水平;實時熒光定量PCR法測定下丘腦 SOCS3 mRNA水平。結果:1)HNE、HHE組血清瘦素水平顯著性低于 H16組(P＜0.05),且 HNE組顯著性低于 HHE及 HN組 (P＜0.01);2)H16組下丘腦LP-Rb水平顯著低于N16組(P＜0.05),HNE及 HHE組較 H16組有顯著性提高;血清瘦素與下丘腦LP-Rb呈微弱負相關性,R值為-0.286(P＜0.05);3)運動、膳食干預提高了 HNE組與 HHE組的p-STAT 3/STAT 3水平,較 H16組有顯著性差異(P＜0.05);4)各組大鼠下丘腦SOCS3 mRNA表達量無顯著性差異(P＞0.05);HNE組、HHE組SOCS3蛋白水平顯著低于 H16組(P＜0.05);HNE組顯著低于 N16組(P＜0.05),而HHE及 HN組顯著高于 HNE組(P＜0.01);大鼠下丘腦 SOCS3蛋白水平與血清瘦素濃度呈低度相關,相關系數(shù) R值為0.338(P＜0.05)。結論:運動聯(lián)合膳食干預較單獨運動或膳食干預可以明顯改善中樞瘦素抵抗,其機制可能與降低血清瘦素水平,上調下丘腦中LP-Rb受體蛋白水平;增加下丘腦中JAK2-STAT 3通路中 STAT 3磷酸化水平;降低下丘腦中SOCS3蛋白水平有關。

運動;膳食;干預;瘦素抵抗;細胞因子信號轉導抑制蛋白3;鼠;動物實驗

Objective:To observe the effect of exercise and diet interventions on central posterior receptor signaling of leptin resistance obese rats in order to study the effect of SOCS3 on leptin resistance.Method:Totally 130 SD male rats were randomly divided into control group(n=10)and model group(n=120).Two groups were fed with common rodent animal feed and high fat diet respectively.After 8 weeks,we selected 1/3 body weight rats ahead in model group,then measure the serum leptin.The model group rats(n=40)were randomized into four groups:high fat diet group(H16),high fat diet and exercise group(HHE),common diet and exercise group(HNE),common diet group(HN).The control group was recorded as N16.Each group rats were given meal intervention or had medium intensity treadmill exercise for 8 weeks.The serum leptin was measured by ELISA.SOCS3,in hypothalamus was observed by Western blot.SOCS3 mRNA in hypothalamus was showed by real time fluorescent quantitation PCR.Result:1)Leptin of HNE,HHE groups were lower than that of H16(P＜0.05),and leptin of HNE group was significantly lower than those of HHE,HN groups(P＜0.01).2)LP-Rb in hypothalamus of H16 group was lower than that of N16 group(P＜0.05);those of HNE,HHE group significantly elevated compared with H16 group(P＜0.05);those of HHE,HN groups were lower than that of HNE group(P＜0.05).LP-Rb in hypothalamus had weaker negative correlation with leptin,r=-0.286,(P＜0.05).3)p-STAT3/STAT3 of HNE,HHE groups elevated because of exercise and diet interventions,compared with H16 group(P＜0.05).4)SOCS3 mRNA of each group had no difference(P＞0.05).SOCS3 of HNE,HHE group was significantly lower than that of H16(P＜0.05),SOCS3 of HNE was lower than that of N16 group(P＜0.05).SOCS3 of HHE,HN group was significantly high-er than that of HNE(P＜0.01).SOCS3 in hypothalamus had low correlation with serum leptin,R=0.338,(P＜0.05).Conclusions:Exercise combination with diet invention was better than exercise or diet to improve central leptin resistance,which mechanisms were possible related to following factors:Leptin lowering,LP-Rb in hypothalamus rising.P-STAT in hypothalamus rising.SOCS3 in hypothalamus lowered.

exercise;diet;intervention;Leptin resistance;SOCS3;rat;animal ex periment

G804.2

A

1000-677X(2011)04-0057-10

2010-12-03;

2011-03-13

上海市第三期運動人體科學重點學科開放基金課題(S30902)。

談艷(1974-),女,安徽蚌埠人,講師,博士,研究方向為運動生理學,Tel:(025)85866343,E-mail:xitanyan@hotmail.com;陳文鶴(1947-),男 ,上海人 ,教授 ,博士研究生導師,研究方向為運動生理學,Tel:(021)51253250,E-mail:wenhechen@126.com。

1.Sports Information Institute,Physical Education Department,Nangjing University of Posts and Telecommunications,Nangjing 210046,China;2.School of Kinesiology,Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China;3.College of Life Sciences,Anhui Normal University,Wuhu 241000,China.