吳 嵽 ,陸耀飛

機(jī)械生長(zhǎng)因子對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活的影響及與其增殖的量效關(guān)系

吳 嵽 ,陸耀飛

骨骼肌損傷是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中很常見(jiàn)的一類(lèi)運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷,其發(fā)生率從10%～55%不等[2]。由于骨骼肌再生能力有限、自然愈合時(shí)程較長(zhǎng)以及瘢痕組織的形成,導(dǎo)致愈合質(zhì)量不可靠。如果反復(fù)損傷,肌肉容易疲勞僵硬、直至肌肉瘢痕或骨化性肌炎形成,最終導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力喪失。如何治療骨骼肌損傷、加快愈合過(guò)程和提高肌肉愈合質(zhì)量,成為迫切需要解決的問(wèn)題。

骨骼肌損傷后,需要激活骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(satellite cell,SC)來(lái)提供足夠的細(xì)胞核,通過(guò)增殖、分化,最終融合形成新的骨骼肌細(xì)胞來(lái)修復(fù)損傷肌纖維。有研究表明,胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)的表達(dá)對(duì)于骨骼肌局部的損傷修復(fù)及肌肉萎縮后的恢復(fù)有作用[3],機(jī)械生長(zhǎng)因子(mechano growth factor,MGF)作為 IGF-1的剪接變構(gòu)體和局部自分泌的生長(zhǎng)因子,在骨骼肌損傷后,先于衛(wèi)星細(xì)胞的激活發(fā)生并持續(xù)到衛(wèi)星細(xì)胞表達(dá)至最大值,且能促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖。因此,有研究做出了骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活可能與MGF有關(guān)的推斷[14]。此外,雖然有研究表明 MGF有促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的作用[15],但是對(duì)于使用的劑量與作用時(shí)間還沒(méi)有明確的定論。

本研究通過(guò)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的離體培養(yǎng),觀察MGF對(duì)于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活作用及促進(jìn)其增殖的量效關(guān)系,探討MGF對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在細(xì)胞和分子水平的調(diào)節(jié)機(jī)制,為骨骼肌損傷的修復(fù)提供了理論依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠2只,4周齡,體重 120 g,清潔級(jí),由上海第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

Dulbecco改良 Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle media,DMEM)(Gibco),胎牛血清(Gibco),馬血清(Gibco),青霉素/鏈霉素(Amresco),II型膠原酶(Sigma),胰蛋白酶+EDTA(上海博光),橫紋肌肌動(dòng)蛋白抗體(α-SCA;武漢博士德),SABC試劑盒(武漢博士德),噻唑蘭(methylthiazol tetrazolium,MTT;上海博光),碘化丙錠(propidium iodide,PI;Sigma)。

1.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞原代培養(yǎng)

10%的水合氯醛以0.4 ml/100 g體重的劑量腹腔麻醉大鼠。

將大鼠浸泡在75%酒精溶液中3 min后,仰臥位固定,無(wú)菌條件下分離兩側(cè)腓腸肌與比目魚(yú)肌。

用骨骼肌清洗液沖洗肌肉3次后,用眼科剪和眼科鑷剝離筋膜、血管和脂肪組織,然后,充分剪碎至1 mm3大小,用骨骼肌清洗液清洗。

在剪碎的骨骼肌中加入0.1%II型膠原酶消化液50 ml,37℃時(shí)在磁力攪拌器攪拌下消化1 h,移入15 ml離心管中,以 1 000 rpm,離心 10 min。棄去上清液后加入0.25%胰蛋白酶30 ml,37℃在磁力攪拌器攪拌下消化15 min后,加入胎牛血清 1 ml終止消化,移入 15 ml離心管中,以1 000 rpm,離心 10 min。棄去上清液,加入 5 ml種植培養(yǎng)液后吹打混勻。收集細(xì)胞懸液,依次通過(guò)100目、200目、400目的不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾。收集濾液后繼續(xù)吹打混勻,制成單細(xì)胞懸液,接種于未經(jīng)多聚賴(lài)氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,種植密度不低于105個(gè)細(xì)胞/ml,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:37℃,5%CO2,100%空氣濕度。2 h后,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液接種到新的未經(jīng)多聚賴(lài)氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。2 h后,將第一次差速貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液接種到經(jīng)多聚賴(lài)氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,48 h后首次換液。之后每隔2天換液一次。

1.4 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞傳代培養(yǎng)

棄培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液,加入0.01 M PBS 1 ml清洗細(xì)胞后,棄去PBS。在培養(yǎng)瓶中加入預(yù)熱至室溫的0.25%胰蛋白酶1 ml,倒置顯微鏡下觀察。觀察到細(xì)胞皺縮變圓,且細(xì)胞間隙增大不再致密后,棄去培養(yǎng)瓶中胰蛋白酶。將培養(yǎng)瓶放入含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中約10 s后取出,倒置顯微鏡下觀察。待大部分細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁脫落時(shí),加入生長(zhǎng)培養(yǎng)液終止消化,并用吸管吹打培養(yǎng)瓶壁,將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁洗脫。按1∶3比例將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中。

1.5 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞純度鑒定

原代培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞傳代,繼續(xù)培養(yǎng)7天。棄去培養(yǎng)板中的生長(zhǎng)培養(yǎng)液,用0.01M PBS清洗1次。4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min后,0.02M PBS清洗3次,3 min/次。梯度酒精脫水:75%,85%,95%各 1次,3 min/次。3%H2O2室溫浸泡10 min,滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后,0.02M PBS清洗3次,3 min/次。滴加5%BSA封閉液,37℃孵育20 min,棄去多余液體,無(wú)需清洗。滴加1∶100稀釋的α-SCA,4℃過(guò)夜后,0.02M PBS清洗3次,3 min/次。滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG,37℃孵育20 min,0.02M PBS清洗3次,3 min/次。滴加試劑SABC,37℃孵育20 min,0.02 M PBS清洗3次,3 min/次。使用DAB試劑盒,取1 ml蒸餾水,加試劑盒中A、B、C試劑各1滴,混勻后加至培養(yǎng)板中,室溫顯色,倒置顯微鏡下觀察,控制反應(yīng)時(shí)間。10 min后用蒸餾水終止反應(yīng),然后用洗滌0.02M PBS清洗。顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),計(jì)算細(xì)胞純度。細(xì)胞純度(%)=(細(xì)胞總數(shù)-陰性細(xì)胞數(shù))÷細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖測(cè)定

1.6.1 分組

空白組:生長(zhǎng)培養(yǎng)液中不加MGF不加細(xì)胞

對(duì)照組:生長(zhǎng)培養(yǎng)液中不加MGF加細(xì)胞

MGF組:10 ng/ml MGF的生長(zhǎng)培養(yǎng)液加細(xì)胞,25 ng/ml MGF的生長(zhǎng)培養(yǎng)液加細(xì)胞,50 ng/ml MGF的生長(zhǎng)培養(yǎng)液加細(xì)胞,100 ng/ml MGF的生長(zhǎng)培養(yǎng)液加細(xì)胞,200 ng/ml MGF的生長(zhǎng)培養(yǎng)液加細(xì)胞

干預(yù)時(shí)間 :24 h、48 h、72 h、96 h。

1.6.2 增殖測(cè)定

取15 ml離心管1支,加入9 ml生長(zhǎng)培養(yǎng)液。將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后,取1 ml加入上述離心管中。用吸管將細(xì)胞吹打混勻后置于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。計(jì)算細(xì)胞懸液的密度:細(xì)胞密度=(4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4)×104個(gè)/ml。用生長(zhǎng)培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為5×103個(gè)/ml后接種到96孔板中,每孔加入100μl。鋪板后每隔30 min觀察1次。2 h后細(xì)胞貼壁,棄去生長(zhǎng)培養(yǎng)液,加入含不同濃度MGF的生長(zhǎng)培養(yǎng)液100μl,同時(shí)設(shè)置空白組、對(duì)照組,每組設(shè)復(fù)孔6個(gè)。在5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng) 20 h、44 h、68 h、92 h后取出培養(yǎng)板 ,棄去生長(zhǎng)培養(yǎng)液后,加入MTT溶液100μl,放入培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)板后,棄去 MTT溶液,加入 DMSO 150μl,振蕩混勻,使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解。選擇波長(zhǎng)490 nm,以空白組(B組)調(diào)零,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值A(chǔ),記錄結(jié)果。

作者單位:上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院,上海200438

1.7 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的同步化

以合適的密度將骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞貼壁后,棄去生長(zhǎng)培養(yǎng)液,無(wú)菌0.01M PBS清洗1～2次后,向培養(yǎng)瓶中加入DMEM 2 ml,放入5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞退出細(xì)胞周期。

1.8 同步化檢測(cè)

取出饑餓24 h后的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,將培養(yǎng)瓶中DMEM收集至離心管中,加無(wú)菌0.01M PBS清洗細(xì)胞,將清洗液收集至離心管中,用胰蛋白酶消化細(xì)胞后,加少量生長(zhǎng)培養(yǎng)液終止消化,將消化液收集至離心管中,再用無(wú)菌PBS清洗培養(yǎng)瓶中剩余細(xì)胞后,將清洗液收集至離心管中。將離心管中細(xì)胞以1 000 rpm,離心6 min后去上清液。再在離心管中加入無(wú)菌0.01M PBS 1 ml,重懸細(xì)胞后,再次以1 000 rpm,將細(xì)胞離心6 min后去上清液。用無(wú)菌0.01M PBS 300μl重懸細(xì)胞后,逐滴加入至含有700 μl于-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇的 EP管中,使乙醇的終濃度為70%,4℃避光保存,放置18 h以上。取出固定于70%乙醇溶液中的細(xì)胞,以1 000 rpm,離心10 min,去上清液。無(wú)菌0.01M PBS清洗2次。將細(xì)胞重懸于 500μl含有Rnase A的 PBS中,37℃避光水浴30 min。細(xì)胞懸液用400目細(xì)胞篩過(guò)濾至流式管中,加入 PI工作液100μl,避光冰上孵育30 min。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.9 細(xì)胞周期檢測(cè)

1.9.1 分組

對(duì)照組 :不含 MGF 的 DMEM 刺激 0 h、8 h、16h、24 h、32 h;MGF組(濃度確定為 25 ng/ml):含 MGF的 DMEM刺激 8 h、16 h、24 h、32 h。

1.9.2 步驟

1.9.2.1 對(duì)照組

取出饑餓24 h后的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后,棄去DMEM,更換新的DMEM,放入含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于 8 h、16 h、24 h、32 h 后取出 ,其余步驟同 1.8。

1.9.2.2 實(shí)驗(yàn)組

取出饑餓24 h后的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后,棄去DMEM,加入含有25 ng/ml MGF的DMEM,放入含有5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ,分別于培養(yǎng)后 8 h、16 h、24 h、32 h 取出,其余步驟同1.8。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

MTT法增殖測(cè)定結(jié)果以平均A值表示,增殖趨勢(shì)采用多因素方差分析,時(shí)間—?jiǎng)┝拷换プ饔貌捎?Tukey-HSD法檢驗(yàn);同一時(shí)間點(diǎn)各組間采用單因素方差分析的LSD法檢驗(yàn);流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果以分別在 G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞所占細(xì)胞數(shù)的比例表示,同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與MGF組之間采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn),組內(nèi)采用單因素方差分析的LSD法檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定和純化

經(jīng)橫紋肌肌動(dòng)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色,骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng),細(xì)胞質(zhì)染成棕色(圖1)。

本實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞。陰性細(xì)胞數(shù)為26個(gè)。

達(dá)到了純化的目的(即細(xì)胞純度≥95%)。

圖1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的橫紋肌肌動(dòng)蛋白免疫化學(xué)染色圖(100×)Figure 1 Skeletal Muscle Satellite Cells Immunochemistry Stained byα-Sarcomeric Actin(100×)

2.2 不同濃度MGF對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響

MGF干預(yù)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞24 h后已進(jìn)入促增殖狀態(tài)。

如圖2:48 h:25 ng/ml組、50 ng/ml組A值顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),10 ng/ml組 A值高于對(duì)照組(P＜0.05),100 ng/ml組、200 ng/ml組與對(duì)照組之間差異沒(méi)有顯著性(P＞0.05),即25 ng/ml組與50 ng/ml組的促增殖作用明顯優(yōu)于10 ng/ml組、100 ng/ml組、200 ng/ml組(P＜0.01),100 ng/ml組與200 ng/ml組的促增殖作用的差異沒(méi)有顯著性 (P＞0.05)。

如圖3:96 h:10 ng/ml組與對(duì)照組之間差異沒(méi)有顯著性 (P＞ 0.05),25 ng/ml組、50 ng/ml組、100 ng/ml組、200 ng/ml組A值顯著高于對(duì)照組和10 ng/ml組 (P＜0.01),25 ng/ml組、50 ng/ml組、100 ng/ml組、200 ng/ml組之間差異沒(méi)有顯著性(P＞0.05)。

結(jié)果顯示,低劑量的MGF即可促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,隨濃度升高至 25 ng/ml至 50 ng/ml時(shí),MGF促骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖作用相對(duì)更明顯,濃度繼續(xù)升高,會(huì)出現(xiàn)增殖速度減緩現(xiàn)象;各個(gè)時(shí)相檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),MGF干預(yù)到96 h增殖速度減緩。結(jié)合時(shí)間—?jiǎng)┝康慕Y(jié)果顯示,在48 h時(shí)25 ng/ml組和50 ng/ml組有交互作用,說(shuō)明在48 h時(shí),濃度在25 ng/ml到50 ng/ml之間的MGF有較好的促增殖作用。

圖2 48 h不同濃度MGF對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響示意圖Figure 2. Effects of MGF on the Dose-dependent Proliferation of Skeletal Muscle Satellite Cells at 48 h

2.3 血清饑餓對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞周期同步化的影響

使用不含血清的DMEM饑餓骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞24 h后,通過(guò)流式細(xì)胞儀上機(jī)測(cè)得處于 G0期的細(xì)胞達(dá)到了86.76%。

2.4 MGF對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞細(xì)胞周期的激活影響

在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞退出細(xì)胞周期后8 h、16 h、24 h和32 h后,通過(guò)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在25 ng/ml的MGF作用下,細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的比例變化(表1)。

如表1所示,8 h時(shí)MGF組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異 (P＞0.05),16 h時(shí)MGF組 G0/G1期細(xì)胞含量低于對(duì)照組(P＞0.05),24 h時(shí) MGF組顯著低于對(duì)照組(P＜0.01),32 h時(shí)MGF組低于對(duì)照組(P＜0.05)。

表1 MGF對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞周期激活影響一覽表T able 1 Effects of MGF on Activation of Skeletal Muscle Satellite Cells (%, ±SD)

結(jié)果顯示,MGF干預(yù)后,處于靜息期的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在16 h后開(kāi)始部分退出 G0期;至32 h大部分細(xì)胞開(kāi)始退出 G0期,重新進(jìn)入細(xì)胞周期。

如圖4所示,MGF組的 G0/G1期細(xì)胞百分比32 h低于 0 h、8 h、16 h和 24 h(P＜ 0.01),說(shuō)明 MGF 干預(yù)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞歷經(jīng)潛伏期后,在32 h能夠明顯激活骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞退出 G0期,使其重新進(jìn)入細(xì)胞周期。

圖4 各個(gè)時(shí)相MGF組中骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞 G0/G1期百分比示意圖Figure 4. Proportion of the Satellites Cells in G0/G1Phase of Operated G roup

3 分析與討論

3.1 MGF對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響因素

本實(shí)驗(yàn)采用了培養(yǎng)的第三代骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,基本排除了自體因素的干擾,能更有效地說(shuō)明MGF對(duì)其的影響。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)定了5個(gè)MGF的不同濃度干預(yù)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖 ,在干預(yù)后 24 h、48 h、72 h、96 h發(fā)現(xiàn):10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml的 MGF 均促進(jìn)了骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,說(shuō)明MGF具有促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的作用,與以往的研究結(jié)果一致[15]。有研究發(fā)現(xiàn),100 ng/ml的 IGF-1和100 ng/ml的 MGF聯(lián)合使用與單獨(dú)使用100 ng/ml的MGF的促增殖作用無(wú)明顯差異[1],而本實(shí)驗(yàn)MTT增殖測(cè)定結(jié)果顯示,MGF促進(jìn)增殖的效果并沒(méi)有隨著濃度的升高而成比例上升:從圖2可知,48 h時(shí)100 ng/ml與200 ng/ml的MGF促增殖作用無(wú)明顯差異(P＞0.05),說(shuō)明在一定范圍內(nèi),MGF促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖具有濃度依賴(lài)性。

從圖3可見(jiàn),96 h后 25 ng/ml組、50 ng/ml組、100 ng/ml組與200 ng/ml組間沒(méi)有差異(P＞0.05),可能是因?yàn)樵?6孔板中每孔添加了100μl含不同濃度 MGF的生長(zhǎng)培養(yǎng)液,在干預(yù)的96 h內(nèi)未經(jīng)換液,持續(xù)到72～96 h時(shí),生長(zhǎng)培養(yǎng)液本身已經(jīng)不能提供骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞足夠的營(yíng)養(yǎng),而在營(yíng)養(yǎng)不足的情況下,細(xì)胞會(huì)漸漸趨向 G0期而停止增殖,開(kāi)始分化;也有可能是由于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中互相接觸后產(chǎn)生了密度依賴(lài)性的生長(zhǎng)抑制,即接觸抑制,細(xì)胞膜上的糖類(lèi)和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的糖蛋白在細(xì)胞上起識(shí)別作用,當(dāng)細(xì)胞增殖到一定程度而相互接觸時(shí),糖蛋白可以識(shí)別該信號(hào),使細(xì)胞停止增殖[9]。

MGF屬于親水性化學(xué)信號(hào)分子,不能直接進(jìn)入細(xì)胞,只能通過(guò)膜表面的特異受體傳遞信號(hào),使靶細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)[4],它與受體的結(jié)合會(huì)引起相應(yīng)的生理反應(yīng),在一定范圍內(nèi),反應(yīng)的強(qiáng)弱與幾何配體的受體數(shù)量呈正相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中,可能在MGF能夠結(jié)合足夠數(shù)量受體的前提下,MGF的濃度越高,骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖越快。從圖2可以看出,25 ng/ml～50 ng/ml的 MGF可能較為接近促進(jìn)其結(jié)合足夠多的受體的濃度范圍,使得骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖效果較明顯,作用的機(jī)制可能是:MGF+MGFR→MGF-MGFR→構(gòu)象改變→RTK(受體型酪氨酸激酶)→啟動(dòng)底物蛋白質(zhì)磷酸化及信號(hào)傳遞→誘導(dǎo)與增殖相關(guān)的基因表達(dá)→細(xì)胞增殖。當(dāng)細(xì)胞持續(xù)處于信號(hào)分子刺激下的時(shí)候,細(xì)胞通過(guò)多種途徑使受體鈍化,產(chǎn)生適應(yīng),如1)修飾或改變受體,如磷酸化,使受體與下游蛋白隔離,即受體失活(receptor inactivation);2)暫時(shí)將受體移到細(xì)胞內(nèi)部,即受體隱蔽(receptor sequestration);3)通過(guò)內(nèi)吞作用,將受體轉(zhuǎn)移到溶酶體中降解,即受體下行調(diào)節(jié)[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),濃度到達(dá)25 ng/ml至 50 ng/ml后,繼續(xù)升高 MGF濃度,增殖的效果卻減弱(圖2),提示,可能是由于 MGF的受體下行調(diào)節(jié),即所有的MGF的特異性受體在結(jié)合了MGF后,并沒(méi)有再循環(huán)利用,而是在溶酶體中降解。關(guān)于MGF的特異性受體,還需要做進(jìn)一步的研究。

3.2 MGF對(duì)激活靜息狀態(tài)下骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的影響因素

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞通常處于靜息狀態(tài),即 G0期,并不分裂[12]。只有在得到信號(hào)刺激的情況下,如骨骼肌受到外力作用或者損傷時(shí),才會(huì)返回細(xì)胞周期,進(jìn)行分裂增殖。體外培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞時(shí),在缺乏某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí),也可以進(jìn)入 G0期,此時(shí)細(xì)胞僅可以生存,但不能分裂,一旦得到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)充,很快會(huì)重返細(xì)胞周期,開(kāi)始細(xì)胞分裂。對(duì) G0期細(xì)胞的生成和它們重返細(xì)胞周期的機(jī)制研究,已越來(lái)越受到人們的重視,這不僅涉及到對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化調(diào)控機(jī)制的探討,而且對(duì)于骨骼肌損傷的治療、藥物設(shè)計(jì)及篩選等,都有重要的指導(dǎo)意義。

通過(guò)細(xì)胞同步化獲得 G0期骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法主要有血清饑餓和接觸抑制。有研究認(rèn)為,血清饑餓優(yōu)于接觸抑制[10],因此,本實(shí)驗(yàn)選用血清饑餓以同步化骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞于 G0期。有研究發(fā)現(xiàn),使用含0.2%胎牛血清(FBS)的DMEM饑餓48 h可以使細(xì)胞 G0/G1期比例達(dá)到68.0%[7];也有研究發(fā)現(xiàn),使用含0.1%FBS的DMEM饑餓48 h可獲得90%以上的 G0期細(xì)胞[6];許家林發(fā)現(xiàn),使用含0.5%FBS的DMEM饑餓60 h可獲得88.75%的G0期細(xì)胞[8]。本實(shí)驗(yàn)嘗試使用不含血清的DMEM對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行饑餓24 h,通過(guò)流式細(xì)胞儀上機(jī)測(cè)得處于G0期的細(xì)胞達(dá)到了86.76%,即有86.76%的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞退出細(xì)胞周期。因此,認(rèn)為不含血清的DMEM也可以達(dá)到較好的同步化效果,并減少了由于饑餓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

流式細(xì)胞儀在細(xì)胞周期研究中應(yīng)用很廣泛。從DNA含量著眼,G1期和G2/M期細(xì)胞含有固定的DNA含量,S期細(xì)胞的DNA含量介于 G1期和 G2/M期之間,應(yīng)用流式細(xì)胞儀,可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞DNA含量在不同時(shí)間內(nèi)的變化,從而確定細(xì)胞所處的各個(gè)周期及其時(shí)間長(zhǎng)短。許家林在 HGF干預(yù)靜息狀態(tài)下骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中選取了5個(gè)時(shí)間段,每個(gè)時(shí)間段為2 h[8],結(jié)果并不理想,因此認(rèn)為需要延長(zhǎng)刺激時(shí)間以觀察到更理想的結(jié)果。又有研究通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)測(cè)定了骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞周期[13],結(jié)果顯示,各個(gè)時(shí)相大致分布為:G1期:14 h;S期:14±1.4 h;G2/M期:4 h,且該研究認(rèn)為,在體的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞周期可能長(zhǎng)于體外實(shí)驗(yàn)中骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞周期所經(jīng)歷的時(shí)間。因此,本實(shí)驗(yàn)將MGF干預(yù)的時(shí)間延長(zhǎng)至32 h,并選取了4個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè),平均每個(gè)時(shí)間段為8 h,以期望能觀察到MGF在干預(yù)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后各個(gè)周期相比率的變化。

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞從 G0期退出后重新進(jìn)入細(xì)胞周期,可以完成一系列的生命活動(dòng):分裂、增殖、分化,融合為新的肌管后形成新的肌纖維,以此修復(fù)受損的骨骼肌。Hill和 G oldspink等通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)推測(cè) MGF可能與激活靜息狀態(tài)下的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期有關(guān)[14],本實(shí)驗(yàn)通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一研究結(jié)果。從表1可知,24 h時(shí)MGF組 G0/G1期細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(P＜0.01),32 h時(shí)MGF組低于對(duì)照組,為68.87%(P＜0.05),因此,可以認(rèn)為MGF干預(yù)后,處于靜息期的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在16 h后開(kāi)始部分退出 G0期,重新進(jìn)入細(xì)胞周期,至32 h大部分細(xì)胞開(kāi)始退出 G0期,重新進(jìn)入細(xì)胞周期。在成體中,肌細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞,退出了細(xì)胞周期不再分裂[5],肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期可能與 Rb基因的表達(dá)產(chǎn)物視網(wǎng)膜瘤(retinoblastoma,Rb)蛋白的去磷酸化有關(guān):Rb蛋白是一種基因調(diào)節(jié)蛋白抑制蛋白,去磷酸化的Rb蛋白具有活性,可同特定的基因調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合,使后者無(wú)法激活與細(xì)胞分裂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。MGF刺激骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞退出細(xì)胞周期,可能的機(jī)制為:MGF與其特異性受體結(jié)合后,激活細(xì)胞內(nèi)一定的信號(hào),經(jīng)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)傳遞,激活 G1期蛋白-Cdk復(fù)合物后,后又激活S期蛋白-Cdk復(fù)合物,使Rb蛋白磷酸化而失去活性,失活的 Rb蛋白釋放出基因調(diào)節(jié)蛋白,激活靶基因的轉(zhuǎn)錄,引起骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。

4 結(jié)論

1.MGF可以促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖。

2.MGF可以激活4周齡SD大鼠的 G0期骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。

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Effects of Mechano Growth Factor on Activation and the Dose-dependent Proliferation of Skeletal Muscle Satellite Cells in Vitro

WU Die,LU Yao-fei

目的:通過(guò)離體實(shí)驗(yàn),觀察機(jī)械生長(zhǎng)因子(MGF)對(duì)于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(SC)的激活作用及促進(jìn)其增殖的量效關(guān)系,探討MGF對(duì)SC在細(xì)胞水平的調(diào)節(jié)機(jī)制,為骨骼肌損傷的修復(fù)提供理論依據(jù)。方法:原代SC取自4周齡雄性SD大鼠雙側(cè)的腓腸肌與比目魚(yú)肌。使用不同濃度的MGF干預(yù)第三代細(xì)胞后測(cè)定增殖效果。血清饑餓后通過(guò)MGF和DMEM干預(yù)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其所處細(xì)胞周期,判斷激活情況。結(jié)果:干預(yù)48 h后,25 ng/ml組、50 ng/ml組 A值顯著高于對(duì)照組 (P＜0.01),100 ng/ml組、200 ng/ml組與對(duì)照組之間差異沒(méi)有顯著性 (P＞0.05);96 h后25 ng/ml組、50 ng/ml組、100 ng/ml組、200 ng/ml組之間差異沒(méi)有顯著性 (P＞0.05)。25 ng/ml MGF干預(yù) G0期的SC 24 h后MGF組低于對(duì)照組 (P＜0.01)。結(jié)論:MGF可以促進(jìn) SC增殖;MGF可以激活4周齡 SD大鼠的 G0期SC。

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞;機(jī)械生長(zhǎng)因子;細(xì)胞培養(yǎng);細(xì)胞增殖;細(xì)胞激活;鼠;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

Objective:This paper observed the effects of MGF on activation and the dose-dependent manner on proliferation of SC in vitro which increasing the number available for local repair,as well as the mechanism at the levels of molecular.Method:The primary passage SC was derived from gastrocnemius muscle and soleus muscle of the Sprague-Dawley rats(4 weeks of age,male).The third passage SC was treated with MGF and the cell proliferation rate was measured by cell proliferation assay.The third passage SC was serum starved and treated with MGF and DMEM.The cell cycle was detected with Flow Cytometry.Result:After 48h,values of the operated groups which treated with MGF of 25ng/ml and 50ng/ml were significantly higher than that of normal control group(P＜0.01).There was no significant difference between 100ng/ml group and 200ng/ml group(P＞0.05).After 96h,there was no significant difference among the operated groups of 25ng/ml,50ng/ml,100ng/ml and 200ng/ml(P＞0.05).There were significant differences between the operated group and the normal control group,the proportion of the SC in G0/G1 phase of operated group treated with 25ng/ml MGF was significantly lower than that in normal control group after 24h(P＜0.01).Conclusion:MGF increases skeletal muscle SC proliferation.MGF appears to initiate skeletal muscle SC activation of 4-week-old Sprague-Dawley rats.

skeletal muscle satellite cell;mechano growth f actor;cell culture;prolif eration;activation;rat;animal ex periment

G804.2

A

1000-677X(2011)02-0064-06

2010-11-01;

2010-12-10

上海市教育委員會(huì)科研項(xiàng)目(05IZ02);上海市第三期重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(S30802)。

吳嵽(1985-),女,江蘇蘇州人,碩士,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生理學(xué),Tel:(025)84755197,E-mail:dale_wo@163.com;陸耀飛 (1961-),男 ,江蘇太倉(cāng)人 ,副教授 ,博士 ,碩士研究生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生理學(xué),Tel:(021)51253470,E-mail:yflu@sus.edu.cn。

Departmentof Kinesiology,ShanghaiUniversityof Sport,Shanghai 200438,China.