吳德峰 ,劉承宜 ,朱 玲

SIRTUIN1介導(dǎo)的NIH3T3成纖維細(xì)胞晝夜節(jié)律時(shí)鐘基因表達(dá)抑制的光生物調(diào)節(jié)作用

吳德峰 ,劉承宜 ,朱 玲

前言

普遍存在的晝夜節(jié)律現(xiàn)象是一種內(nèi)源性的自主的并能自我維持的近似24 h的周期性生理生化過程和行為活動。晝夜節(jié)律和代謝節(jié)律存在著直接的相互作用[39,29],從而使機(jī)體內(nèi)能量的儲存和利用得以同步,以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[33]。哺乳動物的血壓變化和體溫的波動等許多生理和行為受內(nèi)源晝夜節(jié)律時(shí)鐘系統(tǒng)所驅(qū)動,呈現(xiàn)出日震蕩的特點(diǎn)[7]。運(yùn)動員的生理功能當(dāng)然也呈現(xiàn)節(jié)律性變動的特點(diǎn)。晝夜節(jié)律對運(yùn)動員的運(yùn)動能力和狀態(tài)有很大的影響。Bambaeichi等人[9]發(fā)現(xiàn)女性肌肉力量的變化和直腸溫度的節(jié)律性的變化的時(shí)相相同。

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)能夠調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律系統(tǒng)中相關(guān)時(shí)鐘基因的表達(dá)[31,11]。大量的事實(shí)證明,運(yùn)動和重體力作業(yè)能夠?qū)е卵逯?TNF-alpha等細(xì)胞因子的含量增加,但有規(guī)律的體育鍛煉能夠減弱這種應(yīng)激反應(yīng)[14]。Chen等人[12]發(fā)現(xiàn)騎自行車的運(yùn)動員或者打太極拳的中年人體內(nèi)的 TNF-α水平比習(xí)慣于久坐的對照組要高。Andersson等人[6]研究了高強(qiáng)度的耐力運(yùn)動對非專業(yè)運(yùn)動員受試者炎癥反應(yīng)的作用,發(fā)現(xiàn)大量長時(shí)間的耐力運(yùn)動使受試者體內(nèi)的 TNF-alpha顯著升高,同時(shí)他們也發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的體力活動可能具有某種抗炎作用。Gokhale等人[14]也發(fā)現(xiàn),相同頻率的大強(qiáng)度運(yùn)動后,大多數(shù)的運(yùn)動員和非運(yùn)動員血清中的 TNF-alpha等細(xì)胞因子的含量都出現(xiàn)了升高,但運(yùn)動員的升高程度較小,也即運(yùn)動員的這種由于運(yùn)動導(dǎo)致的細(xì)胞因子增多的應(yīng)激反應(yīng)要弱。Vaisberg等人[38]發(fā)現(xiàn),即使是從事有規(guī)律的競技運(yùn)動的運(yùn)動員,如果他產(chǎn)生了慢性疼痛的癥狀,其體內(nèi)的 TNF-alpha等炎癥細(xì)胞因子含量也會升高。

低強(qiáng)度激光或單色光(low intensity laser irradiation or monochromatic light,LIL)照射能夠調(diào)節(jié)生物節(jié)律。Campbell等人[10]發(fā)現(xiàn),膝蓋后月國窩 3 h的明光照射可以引起體溫和唾液褪黑素的生理節(jié)律發(fā)生變化,提出視覺系統(tǒng)之外可能存在可見光的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Extraocular phototransduction,EPT)。然而,Yamazaki等人[41]沒有在敘利亞鼠的視覺外的節(jié)律系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)光受體。Wright等人[40]重復(fù)了 Campbell等人[10]的實(shí)驗(yàn),但沒有發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。為進(jìn)一步驗(yàn)證 Campbell等人[10]所認(rèn)為的光照可以改變時(shí)鐘節(jié)律的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們這里用 TNF-alpha誘導(dǎo)NIH3 T3細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)抑制,然后研究LIL對時(shí)鐘基因表達(dá)的調(diào)控作用,為上述問題和爭論的解決提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3 T3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。Dulbecco’smodified Eagle medium(DMEM)(Hyclone)、青霉素(Sigma)、鏈霉素 (Sigma)、谷氨酰胺(Sigma)、胎牛血清(杭州四季青)、馬血清(Hyclone)、重組鼠 TNF-alpha(Peprotech)、焦碳酸二乙酯(DEPC)(Sigma)、細(xì)胞裂解試劑盒(TaKaRa,TaKaRa RNAiso Plus)、氯仿(天津科密歐)、異丙醇(天津科密歐)、無水乙醇(天津科密歐)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit)、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒(TaKa-Ra,TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTMII)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

1.2.1 常規(guī)培養(yǎng)

使用含雙抗(青霉素100 U/mL;鏈霉素100μg/mL)和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于含5%二氧化碳(CO2)、飽和濕度、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代常規(guī)胰酶消化,注意消化時(shí)間不宜過長,按1∶3傳代,隔天換液。取對數(shù)生長期細(xì)胞,以2×105個/mL密度接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿,細(xì)胞生長匯合后1～2天開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 TNF-alpha抑制NIH3 T3細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)細(xì)胞模型的建立

1.2.2.1 馬血清休克

根據(jù)Balsalobre等人[8]所用方法,于實(shí)驗(yàn)時(shí)間 t=0 h時(shí)刻用含50%馬血清的DMEM培養(yǎng)基替換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基;37℃、5%CO2、飽和濕度孵育 2 h,即到達(dá)同步 NIH3 T3細(xì)胞的時(shí)鐘基因表達(dá)時(shí)相的目的,引起細(xì)胞主要時(shí)鐘基因和鐘控基因能呈現(xiàn)出至少3個周期的晝夜節(jié)律性振蕩表達(dá)而無明顯衰減。

1.2.2.2 TNF-alpha處理

參考Cavadini等人[11]所用實(shí)驗(yàn)方法:將馬血清休克處理2 h的NIH3 T3細(xì)胞置于含有終濃度為10 ng/mL TNF-alpha的無血清DMEM培養(yǎng)基中,常規(guī)孵育培養(yǎng),即可實(shí)現(xiàn) TNF-alpha抑制時(shí)鐘基因表達(dá)的目的,建立起實(shí)驗(yàn)所需模型。Cavadin等人[11]也對不同濃度 TNF-alpha的作用結(jié)果進(jìn)行了探討,我們在這里選擇了一個適中的濃度10 ng/mL TNF-alpha用于建立細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)受抑細(xì)胞模型,既能保證NIH3 T3細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)受到抑制,又不至于 TNF-alpha濃度過高引起細(xì)胞凋亡等。

作者單位:華南師范大學(xué),廣東廣州510006

1.2.3 低強(qiáng)度激光照射處理時(shí)鐘基因表達(dá)抑制的細(xì)胞模型

在NIH3 T3細(xì)胞受高濃度馬血清休克作用2 h后,用含有 TNF-alpha的無血清培養(yǎng)基置換含有高濃度馬血清的DMEM培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基置換后即刻在暗室中給予皿中培養(yǎng)的細(xì)胞以低強(qiáng)度810 nm半導(dǎo)體激光照射處理。照射方式為連續(xù)照射,激光輸出功率為410 mW,實(shí)際照射強(qiáng)度為10 mW/cm2(中央光斑),照射時(shí)間為 20 min。照射完畢后細(xì)胞仍置于含 TNF-alpha的無血清DMEM培養(yǎng)基,常規(guī)條件孵育培養(yǎng),并于第 6 h、12 h、8 h、24 h、30 h、36 h時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞樣品 ,用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測相關(guān)時(shí)鐘基因[11]和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依賴的 Ⅲ型組蛋白去乙?；?1(sirtuin 1,Sirt1)[35]的 mRNA表達(dá),用酶循環(huán)法[26]檢測 NAD+和其還原形式 NADH的比值 NAD+/NADH。(預(yù)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果表明在10 mW/cm2×10 min光照參數(shù)時(shí),LIL照射均可以拮抗 TNF-alpha對 Per2、Dbp基因表達(dá)的抑制。)

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)共分對照組、TNF組、LIL組3組。每組處理方案為,對照組:NIH3 T3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),馬血清休克2 h后,用無血清DMEM(高糖)培養(yǎng)至取材,每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)每個取樣時(shí)間點(diǎn)3個樣品;TNF組:NIH3 T3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),馬血清休克 2 h后,用含 10 ng/mL TNF-alpha的DMEM(高糖)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至取材,每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)每個取樣時(shí)間點(diǎn)3個樣品;LIL組:NIH3 T3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),馬血清休克 2 h后,用含 10 ng/mL TNF-alpha的DMEM(高糖)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的同時(shí)即刻給予皿中培養(yǎng)的細(xì)胞以10 mW/cm2×20 min低強(qiáng)度810 nm半導(dǎo)體激光照射處理,照射完畢后細(xì)胞仍置于含 TNF-alpha的無血清DMEM培養(yǎng)基至取材,每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)每個取樣時(shí)間點(diǎn)3個樣品。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(±SD),t檢驗(yàn)分析組間差異顯著性,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平定為 P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 LIL對 TNF-alpha誘導(dǎo)的 NIH3 T3細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)抑制模型中時(shí)鐘基因 Clock、Bmal1、Dbp和 Per2周期性表達(dá)的影響

根據(jù)熒光定量RT-PCR的統(tǒng)計(jì)結(jié)果,TNF組和對照組相比較表明,TNF-alpha分別在第12 h和第18 h抑制了 Clock(P＜0.05)(圖1)、第 18 h抑制了 Bmall(P＜0.05)(圖2)和 Dbp(P＜0.005)(圖3)及第18 h和第30 h抑制了 Per2(P＜0.05)(圖4)的 mRNA表達(dá)。LIL組和 TNF組比較表明,LIL抑制了 TNF-alpha在第18 h對Clock(P＜0.05)(圖1)和Bmall(P＜0.05)Bmal1(圖2)及第30 h對 Dbp(P＜0.05)(圖3)和Per2(P＜0.005)(圖4)mRNA表達(dá)的抑制作用。LIL組和對照組比較表明,時(shí)鐘基因 Clock(圖1)、Bmal1(圖2)、Dbp(圖3)的 mRNA表達(dá)在LIL組和對照組已無顯著性差異,時(shí)鐘基因 Per2(圖4)的 mRNA表達(dá)在 18 h(P＜0.05)低于對照組,在 30 h(P＜0.05)高于對照組。

圖1 LIL對TNF-alpha誘導(dǎo)的 NIH3T3細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)抑制模型中時(shí)鐘基因 Clock周期性表達(dá)的影響曲線圖Figure 1. The Effect of LIL to Suppressed Expression of CircadianClockG eneClockin Cultured NIH3T3 Fibroblasts Induced by TNF-alpha

圖2 LIL對TNF-alpha誘導(dǎo)的 NIH3T3細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)抑制模型中時(shí)鐘基因Bmal1周期性表達(dá)的影響曲線圖Figure 2. The Effect of LIL to Suppressed Expression of CircadianClockG eneBmal1 in Cultured NIH3T3 Fibroblasts Induced by TNF-alpha

2.2 LIL對 TNF-alpha引起的 NIH3 T3細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)抑制模型中 Sirt1基因的表達(dá)及胞內(nèi)NAD+/NADH的影響

TNF組與對照組相比較表明,TNF-alpha在第18 h和第24 h抑制了 Sirt1(P＜0.05)(圖5)的 mRNA表達(dá),并且在第 6 h、第 12 h、第 18 h和第 30 h降低了NAD+/NADH(P＜0.005)(圖6)的比值。LIL組和TNF組比較表明,LIL抑制了 TNF-alpha在第 18 h對Sirt1(P＜0.005)(圖5)的 mRNA表達(dá)的抑制作用,并且抑制了 TNF-alpha在第6 h(P＜0.005)、第12 h(P＜0.05)和第 18 h(P＜0.05)對 NAD+/NADH(圖6)比值的降低作用。LIL組和對照組比較表明,Sirt1(圖5)的mRNA表達(dá)在第18 h(P＜0.05)高于對照組,胞內(nèi)NAD+/NADH(圖6)的比值在第6 h(P＜0.05)、第12 h(P＜0.005)、第18 h(P＜0.05)和第30 h(P＜0.005)低于對照組。

圖3 LIL對TNF-alpha誘導(dǎo)的 NIH3T3細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)抑制模型中時(shí)鐘基因Dbp周期性表達(dá)的影響曲線圖Figure 3. The Effect of LIL to Suppressed Expression of CircadianClockgeneDbpin Cultured NIH3T3 Fibroblasts Induced by TNF-alpha

圖4 LIL對TNF-alpha誘導(dǎo)的 NIH3T3細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)抑制模型中時(shí)鐘基因 Per2周期性表達(dá)的影響曲線圖Figure 4. The Effect of LIL to Suppressed Expression of CircadianClockgenePer2 in Cultured NIH3T3 Fibroblasts Induced by TNF-alpha

圖5 LIL對TNF-alpha誘導(dǎo)的 NIH3T3細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)抑制模型中Sirt1基因表達(dá)的影響曲線圖Figure 5. The Effect of LIL to Suppressed Expression ofSirt1 in Cultured NIH3T3 Fibroblasts Induced by TNF-alpha

圖6 LIL對TNF-alpha誘導(dǎo)的 NIH3T3細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)抑制模型中胞內(nèi)NAD+/NADH的影響曲線圖Figure 6. The Effect of LIL to Suppressed Expression of NAD+/NADH in Cultured NIH3T3 Fibroblasts Induced by TNF-alpha

3 討論

3.1 LIL抑制 TNF-alpha誘導(dǎo)的時(shí)鐘基因表達(dá)下調(diào)

功能內(nèi)穩(wěn)態(tài)(function-specific homeostasis,FSH)利用負(fù)反饋機(jī)制抵制內(nèi)外干擾,維持功能發(fā)揮所需要的內(nèi)部漲落,實(shí)現(xiàn)功能充分穩(wěn)定的發(fā)揮[1]。LIL對處于 FSH的功能無效,但可以調(diào)節(jié)遠(yuǎn)離 FSH的功能[1]。在本實(shí)驗(yàn)中,TNF-alpha抑制了經(jīng)過馬血清誘導(dǎo)的 NIH3 T3細(xì)胞中時(shí)鐘基因的表達(dá),時(shí)鐘基因的表達(dá)遠(yuǎn)離了時(shí)鐘基因表達(dá)內(nèi)穩(wěn)態(tài)(Clock-gene-expression-specific homeostasis,Cg-SH),LIL則促進(jìn)時(shí)鐘基因的表達(dá)建立CgSH。

Cavadini等人[11]研究了馬血清休克處理后的0、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h 中 10 ng/mL TNF-alpha對NIH3 T3細(xì)胞中時(shí)鐘基因mRNA表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)在前12 h TNF-alpha對時(shí)鐘基因的表達(dá)沒有影響 ,在 20 h、24 h、28 h中 TNF-alpha則顯著抑制了 Dbp、Per2等時(shí)鐘基因的表達(dá)。在我們的實(shí)驗(yàn)中LIL在前24 h對 TNF-alpha誘導(dǎo)的時(shí)鐘基因 Dbp、Per2表達(dá)下調(diào)沒有影響,LIL顯著抑制 TNF-alpha誘導(dǎo)的時(shí)鐘基因 Dbp、Per2表達(dá)下調(diào)的作用也發(fā)生在第30 h。另外,與Cavadini等人[11]有所不同,我們發(fā)現(xiàn),分別在12 h、18 h和 18 h分別抑制了 Clock、Bmal1的表達(dá),而在 18 h這一時(shí)刻LIL抑制了 TNF-alpha的作用。因此,可以發(fā)現(xiàn)只有在TNF-alpha已經(jīng)改變了時(shí)鐘基因表達(dá)的情況下,LIL的光生物調(diào)節(jié)作用才能夠?qū)?TNF-alpha的這種作用產(chǎn)生影響;在 TNF-alpha對時(shí)鐘基因的表達(dá)沒有影響之前,則此時(shí)LIL對時(shí)鐘基因的表達(dá)也沒有任何作用。我們分析這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是,如果TNF對mRNA的表達(dá)沒有影響,說明相關(guān)的功能處于 FSH,LIL當(dāng)然沒有影響;如果TNF抑制mRNA的表達(dá),則說明相關(guān)的功能遠(yuǎn)離 FSH,此時(shí)LIL對其具有調(diào)節(jié)作用。

從CgSH的角度來看,Wright等人[40]和 Campbell等人[10]兩個研究小組的結(jié)果并不矛盾。在 Wright等人[40]的實(shí)驗(yàn)中健康受試者所處的環(huán)境全黑(0 lux),時(shí)鐘基因的表達(dá)處于CgSH,生理節(jié)律當(dāng)然不受影響。Campbell等人[10]實(shí)驗(yàn)中健康受試者處在有微弱燈光的環(huán)境(＜50 lux),時(shí)鐘基因的表達(dá)遠(yuǎn)離CgSH,生理節(jié)律受到干擾,正如本研究實(shí)驗(yàn)所發(fā)現(xiàn)的,LIL可以促進(jìn)時(shí)鐘基因的表達(dá)恢復(fù)CgSH,當(dāng)然可以調(diào)節(jié)生理節(jié)律。

3.2 LIL抑制 TNF-alpha誘導(dǎo)的時(shí)鐘基因表達(dá)下調(diào)與Sirt1有關(guān)

近年的研究表明,NAD+依賴的 Sirt1在晝夜節(jié)律時(shí)鐘基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中具有重要作用。在構(gòu)成晝夜節(jié)律系統(tǒng)的相關(guān)蛋白中,其核心組分 Clock蛋白具有組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性,通過對組蛋白和非組蛋白的乙酰化導(dǎo)致相關(guān)時(shí)鐘基因染色質(zhì)形態(tài)的改變進(jìn)而激活其表達(dá),而Sirt1能夠平衡 Clock蛋白的乙?；饔?進(jìn)而與 Clock一起在時(shí)鐘基因表達(dá)的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。Sirt1的去乙?；富钚砸蕾囉贜AD+,每催化一分子的乙酰化賴氨酸殘基的去乙?；饔眯枰纸庖环肿拥腘AD+產(chǎn)生煙堿(nicotinamide,NAM)和氧代乙?；?ADP核糖基(O-acetyl-ADP-ribose)。Sauve等人[37]和 Nakahata等人[30]發(fā)現(xiàn),野生小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(wild-type mouse embryonic fibroblasts,WT MEFs)中胞內(nèi) NAD+的震蕩時(shí)相與 Sirt1去乙酰化活性的時(shí)相相同,與組蛋白 H3和Bmal1的乙?；瘯r(shí)相正好相反。

為了進(jìn)一步探究LIL通過何種途徑來影響本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?TNF-alpha對時(shí)鐘基因表達(dá)的抑制作用,本文同時(shí)檢測了細(xì)胞中 Sirt1的mRNA表達(dá)水平及胞內(nèi)NAD+/NADH的比值變化情況。本文發(fā)現(xiàn),LIL整體提高了胞內(nèi) Sirt1的表達(dá)及 NAD+/NADH水平。Sirt1的活性依賴于NAD+的水平。因此,LIL既提高了 Sirt1的mRNA表達(dá),又提高了 Sirt1蛋白的活性。

近年來的研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇和槲皮素等多酚類物質(zhì)可以提高 Sirt1活性[17]。多酚類物質(zhì)的濃度越高,Sirt1活性提高的程度也越高。白藜蘆醇和槲皮素等多酚類物質(zhì)也能調(diào)節(jié) TNF-alpha誘導(dǎo)的細(xì)胞中眾多基因表達(dá)的變化,并且都是通過或者部分通過抑制核因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-kappa B)信號通路實(shí)現(xiàn)的。Zhu等人[44]發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能夠抑制3 T3-L1脂肪細(xì)胞中 TNF-alpha誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)表達(dá)的下調(diào),更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇抑制了 TNF-alpha處理的3 T3-L1脂肪細(xì)胞中 NF-kappaB的轉(zhuǎn)錄活性。Yu等人[43]研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能夠抑制人肝癌細(xì)胞中 TNF-alpha誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表達(dá),并且這種作用至少部分的與白藜蘆醇對 NF-kappa B信號通路的下調(diào)有關(guān)。Csiszar等人[13]發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能夠抑制人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(human coronary arterial endothelial cells,HCAECs)中 TNF-alpha誘導(dǎo)的NF-kappaB的激活及NF-kappaB依賴的一系列炎癥基因的表達(dá)。Moon等人[27]發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能夠抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞中 TNF-alpha誘導(dǎo)的趨化因子 Fractalkine的表達(dá),這種抑制作用部分的是通過抑制NF-kappaB的活性來實(shí)現(xiàn)的。Lee等人[20]發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能夠抑制人血管平滑肌細(xì)胞中 TNF-alpha誘導(dǎo)的MMP-9的表達(dá),這種抑制作用部分的是通過轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB來實(shí)現(xiàn)的。Lotito等人[23]發(fā)現(xiàn),槲皮素等能夠抑制 TNF-alpha誘導(dǎo)的人主動脈上皮細(xì)胞中內(nèi)皮黏附分子的表達(dá)。Lee等人[21]證實(shí),黃酮類如槲皮素等能夠抑制 HEK 293細(xì)胞中由 TNF-alpha誘導(dǎo)的IL-8啟動子的激活和基因表達(dá),并且抑制了 TNF-alpha處理的 HEK 293細(xì)胞中NF-kappaB的激活。Sato等人[36]發(fā)現(xiàn),槲皮素能夠抑制人滑膜細(xì)胞中 TNF-alpha或 H2O2誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-8(interleukin 8,IL-8)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的表達(dá),這種抑制作用至少部分的是通過抑制NF-kappa B的激活實(shí)現(xiàn)的。另外,白藜蘆醇還能直接阻止 NF-kappa B的激活。Heynekamp等人[16]指出,白藜蘆醇是一個已知的NF-kappaB的激活的抑制劑。Manna等人[25]證實(shí),白藜蘆醇能夠以劑量依賴的方式阻止 TNF-alpha誘導(dǎo)的 NF-kappaB的激活。Pfluger等人[32]研究證實(shí),發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比,給予18周高脂肪飲食后,基因重組適當(dāng)超表達(dá) Sirt1(為野生型的 2～4倍)的重組小鼠雖然在實(shí)驗(yàn)過程中攝入更多的食物,但其卻具有較低的體重和脂肪量,并且,具有低NF-kappaB活性,抑制了肝臟炎癥的產(chǎn)生。因此,可以發(fā)現(xiàn),Sirt1在較低劑量或者適當(dāng)超表達(dá)情況下抑制 TNF-alpha自身的表達(dá)及 TNF-alpha對其他基因的調(diào)節(jié)作用,以及能夠抑制NF-kappaB的激活。

本實(shí)驗(yàn)中,LIL抑制 TNF-alpha誘導(dǎo)的時(shí)鐘基因表達(dá)下調(diào)的作用類似于藜蘆醇和槲皮素等多酚類物質(zhì)對TNF-alpha誘導(dǎo)的細(xì)胞中眾多基因表達(dá)變化的調(diào)節(jié)作用。LIL照射既提高了 Sirt1的 mRNA表達(dá)又提高了Sirt1蛋白的活性,進(jìn)而抑制 TNF-alpha誘導(dǎo)的時(shí)鐘基因表達(dá)的下調(diào)。其中可能的分子機(jī)制是,Sirt1通過抑制NF-kappaB信號通路后,進(jìn)一步抑制 TNF-alpha的作用從而起到間接的調(diào)節(jié)作用。

3.3 LIL影響mRNA表達(dá)的作用特點(diǎn)

“分子生物學(xué)中心法則”認(rèn)為,DNA儲存的信息決定RNA序列,而RNA序列決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);而多肽中的特異氨基酸序列則是由mRNA上的核苷酸序列所決定,即由mRNA傳遞DNA的編碼信息;生物的遺傳信息儲存在DNA的核苷酸序列中代代相傳,這些信息的選擇性表達(dá)則需要通過轉(zhuǎn)錄的方式從細(xì)胞核的“數(shù)據(jù)庫”中以mRNA的形式提取特異的、準(zhǔn)確的信息,并運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行蛋白質(zhì)合成;mRNA是遺傳信息從基因組到核糖體的直接載體;而由RNA聚合酶介導(dǎo)的 RNA轉(zhuǎn)錄的起始也可能是控制基因表達(dá)的最重要步驟。由此可見,mRNA表達(dá)在整個遺傳信息傳遞的過程中起著相當(dāng)重要的作用。因此,LIL對mRNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)作用在調(diào)控細(xì)胞整體的基因表達(dá)方面具有十分重要的意義。

LIL影響mRNA表達(dá)的通路可能是細(xì)胞整體的氧化還原電位[18],也可能是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[45,15]。不同的細(xì)胞在生長條件范圍內(nèi)具有不同的氧化還原態(tài),正如 Karu[18]所指出的,細(xì)胞氧化還原電位較低的還原態(tài)(細(xì)胞內(nèi)p H低)遠(yuǎn)離內(nèi)穩(wěn)態(tài),對LIL的響應(yīng)潛力較大;細(xì)胞最佳的氧化還原態(tài)處于內(nèi)穩(wěn)態(tài),對LIL沒有響應(yīng)。細(xì)胞中許多重要的調(diào)節(jié)通路是通過氧化還原態(tài)來介導(dǎo)的。氧化還原態(tài)的改變能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)眾多的信號通路的激活,調(diào)節(jié)核酸合成,蛋白質(zhì)合成,酶的活化,細(xì)胞周期進(jìn)展等[22]。這些細(xì)胞溶質(zhì)的反應(yīng)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的改變。許多轉(zhuǎn)錄因子能夠被細(xì)胞氧化還原態(tài)的變化所調(diào)節(jié),包括氧化還原因子1(redox factor-1,Ref-1)依賴的激活蛋白因子1(activator protein-1,AP-1),NF-kappa B,P53,轉(zhuǎn)錄激活因子/cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(activating transcription factor/cAMP-response element-binding protein ,ATF/CREB),低氧誘導(dǎo)因子(hypoxiainducible factor,HIF)-1α,低氧誘導(dǎo)因子樣因子(HIF-like factor)。通常氧化還原依賴的轉(zhuǎn)錄因子的氧化形式具有較低的DNA結(jié)合能力。Ref-1是這些轉(zhuǎn)錄因子特異還原的一個重要因子。人們發(fā)現(xiàn)低水平的氧化劑能夠刺激某些類型的細(xì)胞的增殖和分化[42,19,5]。

3.4 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在體育運(yùn)動中的可能應(yīng)用

運(yùn)動員尤其是優(yōu)秀運(yùn)動員經(jīng)常需要跨區(qū)域參加一些大型的體育賽事,會出現(xiàn)時(shí)差綜合癥。當(dāng)快速跨越多個時(shí)區(qū)時(shí),體內(nèi)晝夜節(jié)律系統(tǒng)原有的時(shí)間程序和新環(huán)境中的晝夜循環(huán)周期發(fā)生沖突[28],導(dǎo)致內(nèi)源性節(jié)律系統(tǒng)發(fā)生轉(zhuǎn)變出現(xiàn)短暫的去同步化,直至內(nèi)源性的節(jié)律和外界環(huán)境晝夜循環(huán)的時(shí)相相同[24]。時(shí)差綜合癥最常見的癥狀是睡眠障礙、注意集中困難、易怒、抑郁、疲乏、方向感喪失、食欲不振、胃腸道功能紊亂、運(yùn)動能力和狀態(tài)下降等精神和身體狀態(tài)的下降[28,24]。Reinberg等人[34]推薦將時(shí)間生物學(xué)的方法運(yùn)用到體育研究中來。

本研究為時(shí)差綜合癥的解決提供了新的選擇,即LIL照射可用于改善睡眠質(zhì)量。腘窩照射可以調(diào)節(jié)生物節(jié)律[10]。鼻腔內(nèi)低強(qiáng)度激光照射治療(intranasal low intensity laser irradiation,ILIL T)也是一種治療失眠癥的綠色治療方法[1]。王芳[2]用3 mW的低強(qiáng)度650 nm GaInP/AlGaInP半導(dǎo)體激光鼻腔內(nèi)照射治療50例患者,單側(cè)30 min,每天1次,每個療程10～14天,共1～2療程。結(jié)果顯效41例(82%),有效4例(8%),無效5例(10%)。許長春等人[3]用3.5～4.5 mW的低強(qiáng)度氦氖激光鼻腔內(nèi)照射治療了38名失眠癥患者,每次照射 30 min,每天1次,每個療程10天,共兩個療程。他們發(fā)現(xiàn) ILIL T可以增加血清褪黑素。許長春等人[4]進(jìn)一步用3.5～4.5 mW的低強(qiáng)度氦氖激光鼻腔內(nèi)照射治療了128名失眠癥患者,每次照射30 min,每天一次,共10天。他們發(fā)現(xiàn)多導(dǎo)睡眠圖獲得改善。

4 結(jié)論

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在證實(shí) TNF-alpha具有干擾哺乳動物細(xì)胞中時(shí)鐘基因表達(dá)作用的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)LIL抑制了 TNF-alpha誘導(dǎo)的時(shí)鐘基因表達(dá)的下調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LIL的光生物調(diào)節(jié)作用通過提高 Sirt1的mRNA表達(dá)和 Sirt1蛋白的活性抑制了 TNF-alpha的作用。本實(shí)驗(yàn)為LIL對失眠和時(shí)差綜合癥等生物節(jié)律相關(guān)疾病的治療提供了理論依據(jù)。

[1]劉承宜,朱平.低強(qiáng)度激光鼻腔內(nèi)照射療法[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2009:50-413.

[2]王芳.鼻腔內(nèi)激光照射治療失眠的療效觀察與護(hù)理[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志,2006,4(3):58.

[3]許長春,王黎荔,劉軍方,等.低能量 He-Ne激光腦定向治療失眠癥[J].前衛(wèi)醫(yī)藥雜志,2001,18(5):337-338.

[4]許長春,仵震宇,王黎荔,等.低能量 He-Ne激光治療失眠癥對睡眠腦電圖的影響[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志,2002,19(6):407-408.

[5]ALALUF S,MUIR-HOWIE H,HU H L,et al.Atmospheric oxygen accelerates the induction of a post-mitotic phenotype in human dermal fibroblasts:the key protective role of glutathione[J].Differentiation,2000,66(2-3):147-155.

[6]ANDERSSON J,JANSSON J H,HELLSTEN G,et al.Effects of heavy endurance physical exercise on inflammatory markers in non-athletes[J].Atherosclerosis,2010,209(2):601-605.

[7]ASHER G,GATFIELD D,STRATMANN M,et al.Sirt1 regulates circadianClockgene expression throughPer2 deacetylation[J].Cell,2008,134(2):317-328.

[8]BALSALOBRE A,DAMIOLA F,SCHIBLER U,et al.A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue[J].Cell,1998,93(6):929-937.

[9]BAMBAEICHI E,REILL Y T,CABLE N T,et al.Influence of time of day and partial sleep loss on muscle strength in eumenorrheic females[J].Ergonomics,2005,48(11-14):1499-1511.

[10]CAMPBELL S S,MURPHY P J.Extraocular circadian phototransduction in humans[J].Sci,1998,279(5349):396-399.

[11]CAVADINI G,PETRZIL KA S,KOHLER P,et al.TNF-alpha suppresses the expression ofClockgenes by interfering with E-box-mediated transcription[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(31):12843-12848.

[12]CHEN Y Y,CHIANGJ,CHEN YJ,et al.Cycling and Tai Chi Chuan exercises exert greater immunomodulatory effect on surface antigen expression of human hepatitis B virus[J].ChinMed J(Engl),2008,121(21):2172-2179.

[13]CSISZAR A,SMITH K,LABINSKYY N,et al.Resveratrol attenuates TNF-alpha-induced activation of coronary arterial endothelial cells:role of NF-kappaB inhibition[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291(4):H1694-H1699.

[14]GOKHALE R,CHANDRASHEKARA S,VASANTHAKUMAR K C.Cytokine response to strenuous exercise in athletes and non-athletes-an adaptive response[J].Cytokine,2007,40(2):123-127.

[15]HAMBLIN M R,WAYNANT R W,ANDERS J.Mechanisms for low-light therapy[M].Belligham:Proc SPIE,2006.

[16]HEYNEKAMP J J,WEBER W M,HUNSAKER L A,et al.Substituted trans-stilbenes,including analogues of the natural product resveratrol,inhibit the human tumor necrosis factor alpha-induced activation of transcription factor nuclear factor kappaB[J].J Med Chem,2006,49(24):7182-7189.

[17]HOWITZ K T,BITTERMAN K J,COHEN H Y,et al.Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan[J].Nature,2003,425(6954):191-196.

[18]KARU T.Primary and secondary mechanisms of action of visible to near-IR radiation on cells[J].J Photochem Photobiol B,1999,49(1):1-17.

[19]KIRLIN W G,CAIJ,THOMPSON S A,et al.Glutathione redox potential in response to differentiation and enzyme inducers[J].Free Radic Biol Med,1999,27(11-12):1208-1218.

[20]LEE B,MOON S K.Resveratrol inhibits TNF-alpha-induced proliferation and matrix metalloproteinase expression in human vascular smooth muscle cells[J].J Nut,2005,135(12):2767-2773.

[21]LEE S,KIM Y J,KWON S,et al.Inhibitory effects of flavonoids on TNF-alpha-induced IL-8 gene expression in HEK 293 cells[J].BMB Rep,2009,42(5):265-270.

[22]LIU H,COLAVITTI R,ROVIRA II,et al.Redox-dependent transcriptional regulation[J].Circ Res,2005,97(10):967-974.

[23]LOTITO S B,FREI B.Dietary flavonoids attenuate tumor necrosis factor alpha-induced adhesion molecule expression in human aortic endothelial cells.Structure-function relationships and activity after first pass metabolism[J].J Biol Chem,2006,281(48):37102-37110.

[24]MANFREDINI R,MANFREDINI F,FERSINI C,et al.Circadian rhythms,athletic performance,and jet lag[J].Br J Sports Med,1998,32(2):101-106.

[25]MANNA S K,MUKHOPADHYAY A,AGGARWAL B B.Resveratrol suppresses TNF-induced activation of nuclear transcription factors NF-kappa B,activator protein-1,and apoptosis:potential role of reactive oxygen intermediates and lipid peroxidation[J].J Immunol,2000,164(12):6509-6519.

[26]MENZEL K,AHRENS K,ZENG A,et al.Kinetic,dynamic,and pathway studies of glycerol metabolism by Klebsiella pneumoniae in anaerobic continuous culture:IV.Enzymes and fluxes of pyruvate metabolism[J].Biotechnol Bioeng,1998,60(5):617-626.

[27]MOON S O,KIM W,SUNG M J,et al.Resveratrol suppresses tumor necrosis factor-alpha-induced fractalkine expression in endothelial cells[J].Mol Pharmacol,2006,70(1):112-119.

[28]MURPHY B A,ELLIOTT J A,SESSIONS D R,et al.Rapid phase adjustment of melatonin and core body temperature rhythms following a 6-h advance of the light/dark cycle in the horse[J].J Circadian Rhythms,2007,5:5.

[29]NAKAHATA Y,KALUZOVA M,GRIMALDI B,et al.The NAD+-dependent deacetylaseSirt1 modulatesClock-mediated chromatin remodeling and circadian control[J].Cell,2008,134(2):329-340.

[30]NAKAHATA Y,SAHAR S,ASTARITA G,et al.Circadian control of the NAD+salvage pathway byClock-Sirt1[J].Sci,2009,324(5927):654-657.

[31]PETRZIL KA S,TARABORRELLI C,CAVADINI G,et al.Clockgene modulation by TNF-alpha depends on calcium and p38 MAP kinase signaling[J].J Biol Rhythms,2009,24(4):283-294.

[32]PFLUGER P T,HERRANZ D,VELASCO-MIGUEL S,et al.Sirt1 protects against high-fat diet-induced metabolic damage[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(28):9793-9798.

[33]RAMSEY K M,YOSHINO J,BRACE C S,et al.Circadian Clockfeedback cycle through NAMPT-mediated NAD+biosynthesis[J].Science,2009,324(5927):651-654.

[34]REINBERG A,PROUX S,BARTAL J P,et al.Circadian rhythms in competitive sabre fencers:internal desynchronization and performance[J].Chronobiol Int,1985,2(3):195-201.

[35]RODGERS J T,LERIN C,HAAS W,et al.Nutrient control of glucose homeostasis through a complex of PGC-1alpha and Sirt1[J].Nature,2005,434(7029):113-118.

[36]SATO M,MIYAZAKI T,KAMBE F,et al.Quercetin,a bioflavonoid,inhibits the induction of interleukin 8 and monocyte chemoattractant protein-1 expression by tumor necrosis factoralpha in cultured human synovial cells[J].J Rheumatol,1997,24(9):1680-1684.

[37]SAUVE A A,WOLBERGER C,SCHRAMM V L,et al.The biochemistry of sirtuins[J].Annu Rev Biochem,2006,75:435-465.

[38]VAISBERG M,DE MELLO M T,SEELAENDER M C,et al.Reduced maximal oxygen consumption and overproduction of proinflammatory cytokines in athletes[J].Neuroimmunomodulation,2007,14(6):304-309.

[39]WIJNEN H,YOUNG M W.Interplay of circadianClocks and metabolic rhythms[J].Annu Rev Genet,2006,40:409-448.

[40]WRIGHT KP J R,CZEISLER C A.Absence of circadian phase resetting in response to bright light behind the knees[J].Sci,2002,297(5581):571.

[41]YAMAZAKI S,GOTO M,MENAKER M.No evidence for extraocular photoreceptors in the circadian system of the Syrian hamster[J].J Biol Rhythms,1999,14(3):197-201.

[42]YANG M,NAZHAT N B,JIANG X,et al.Adriamycin stimulates proliferation of human lymphoblastic leukaemic cells via a mechanism of hydrogen peroxide(H2O2)production[J].Br J Haematol,1996,95(2):339-344.

[43]YU H,PAN C,ZHAO S,et al.Resveratrol inhibits tumor necrosis factor-alpha-mediated matrix metalloproteinase-9 expression and invasion of human hepatocellular carcinoma cells[J].Biomed Pharmacother,2008,62(6):366-372.

[44]ZHU J,YONG W,WU X,et al.Anti-inflammatory effect of resveratrol on TNF-alpha-induced MCP-1 expression in adipocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,369(2):471-477.

[45]ZHU L,LIU T C Y,WU M,et al.Extraocular cellular phototransduction[J].J Innovation Optical Health Sci,2009,2(1):93-100.

Sirtuin1-mediated Photobiomodulation on TNF-alpha Inhibited Expression of Circadian ClockGenes in Cultured NIH3T3 Fibroblasts

WU De-feng,LIU Cheng-yi,ZHU Ling

背景和目的:晝夜節(jié)律是影響運(yùn)動成績的一個重要因素。研究發(fā)現(xiàn),介導(dǎo)運(yùn)動應(yīng)激的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)能夠抑制晝夜節(jié)律時(shí)鐘基因的表達(dá)。研究了低強(qiáng)度810 nm激光(low intensity 810 nm laser irradiation,LIL)對TNF抑制效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。材料和方法:50%馬血清休克處理NIH3 T3成纖維細(xì)胞2 h,同步化晝夜節(jié)律時(shí)鐘基因的表達(dá)后,加入10 ng/mL TNF-alpha抑制它的表達(dá),與此同時(shí)給予20 min10 mW/cm2的LIL照射。36 h內(nèi),每隔6 h檢測細(xì)胞中時(shí)鐘基因 Clock、Bmal1、Per2、Dbp和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依賴的組蛋白去乙酰化酶1(sirtuin 1,Sirt1)的mRNA的表達(dá)及胞內(nèi)NAD+和其還原形式NADH的比值NAD+/NADH。結(jié)果:TNF-alpha分別在第12 h和第18 h抑制了 Clock(P＜0.05)、第18 h抑制了 Bmall(P＜0.05)和 Dbp(P＜0.005)、第18 h和第30 h抑制了 Per2(P＜0.05)及第18 h和第 24 h抑制了 Sirt1(P＜0.05)的 mRNA表達(dá),并且在第6 h、第12 h、第 18 h和第30 h降低了NAD+/NADH(P＜0.005)的比值。LIL抑制了 TNF-alpha在第18 h對Clock(P＜0.05)、Bmall(P＜0.05)和 Sirt1(P＜0.005)及第30 h對 Dbp(P＜0.05)和Per2(P＜0.005)的抑制作用,并且抑制了 TNF-alpha在第 6 h(P＜0.005)、第12 h(P＜0.05)和第18 h(P＜0.05)對NAD+/NADH比值的降低作用。結(jié)論:LIL對被 TNF-alpha抑制的晝夜節(jié)律時(shí)鐘基因表達(dá)的促進(jìn)作用可能是通過NAD+/Sirt1介導(dǎo)的。

晝夜節(jié)律時(shí)鐘基因;腫瘤壞死因子;光生物調(diào)節(jié)作用

Background and Objective:Circadian rhythm is one of the important factors on athletic performance.Tumor necrosis factor(TNF),which mediates sport stress,has been shown to inhibit the expression of circadianClockgenes.The modulation of low intensity 810 nm laser irradiation(LIL)on the inhibition was studied in this paper.Study design/materials and method:The expression of the circadianClockgenes in NIH3 T3 fibroblasts was synchronized by 50%horse serum shock for 2h,inhibited with TNF-alpha at 10ng/mL,and then irradiated with LIL at 10 mW/cm2for 20 min.The mRNA expression of the circadianClockgenes and Sirtuin 1(Sirt1),and the ratio of nicotinamide adenine dinucleotide(NAD+)and its reduced form NADH,NAD+/NADH,were assessed every 6h for 36h.Result:TNF-alpha inhibited the mRNA expression ofClock(P＜0.05)at 12thand 18thh,Bmall(P＜0.05)andDbp(P＜0.005)at 18thh,Per2(P＜0.05)at 18thand 30thh,andSirt1(P＜0.05)at 18thand 24th h,respectively,and decreased NAD+/NADH(P＜0.005)at 6th,12th,18thand 30thh,respectively.LIL inhibited the effects of TNF-alpha onClock(P＜0.05),Bmall(P＜0.05)andSirt1(P＜0.005)at 18thh,Dbp(P＜0.05)and Per2(P＜0.005)at 30thh,and NAD+/NADH at 6th(P＜0.005),12th(P＜0.05)and 18th(P＜0.05),respectively.Conclusion:The promotion of LIL on TNF-alpha inhibited expression of the circadianClockgenes may be mediated by NAD+/Sirt1.

circadianClockgenes;tumor necrosis f actor(TN F);photobiomodultion

G804.2

A

1000-677X(2011)02-0042-07

2010-11-28;

2011-01-10

國家自然科學(xué)基金(60878061)。

吳德峰(1985-),男,河南商城人,在讀碩士研究生,主要研究方向?yàn)榧?xì)胞生理與信息,Tel:(020)39312173,E-mail:wudefeng@163.com;劉承宜(1963-),男 ,四川大竹人,博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,研究方向?yàn)閮?nèi)穩(wěn)態(tài)理論及其在體育科學(xué)、激光醫(yī)學(xué)和康復(fù)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,Tel:(020)85213369,E-mail:liutcy@scnu.edu.cn;朱玲(1979-),女,四川宜賓人,講師,博士,研究方向?yàn)檫\(yùn)動生物化學(xué)理論及其在體育科學(xué)、激光醫(yī)學(xué)和康復(fù)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,Tel:(020)84720359,E-mail:zhul@scnu.edu.cn。

South China Normal University,Guangzhou 510006,China.