吳 思， 田 晶， 許 衛(wèi) 萍

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034;2.大連工業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代教育技術(shù)部， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

微生物代謝指紋分析已經(jīng)被廣泛用于微生物的生理、生化和調(diào)控等特征的研究，在醫(yī)學(xué)、環(huán)境和工業(yè)微生物等領(lǐng)域獲得了很大成功[1-4]。目前代謝指紋分析中常采用的分析技術(shù)包括核磁共振 (NMR)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS) 以及毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜等技術(shù)[5-7]。其中GC-MS由于其高靈敏性和具有化合物標(biāo)準(zhǔn)譜庫 (NIST) 而得到了更為普遍的應(yīng)用[7-8]。

GC-MS代謝指紋分析采用的是EI源，因此一次可以產(chǎn)生大量(化合物碎片)數(shù)據(jù)，其中包括有價(jià)值的信息，還包括了許多干擾信息，有些可能是來源于分析方法，有些來自于分析儀器自身，還有一些來源于樣品本身。這些不可靠數(shù)據(jù)的存在常常會(huì)給代謝指紋分析帶來許多干擾。雖然目前關(guān)于代謝指紋分析的原始數(shù)據(jù)處理和后續(xù)的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析有許多方法，但是大部分方法更多的是遵循基本的純統(tǒng)計(jì)學(xué)原則，而沒有更有效地結(jié)合生物學(xué)意義進(jìn)行分析[8-11]。為克服上述缺陷，進(jìn)而能相對(duì)合理、準(zhǔn)確地利用代謝指紋數(shù)據(jù)，有效地從龐大的代謝指紋宏數(shù)據(jù)中分析、提取有價(jià)值的信息尤為重要。本研究采用一種結(jié)合生物學(xué)意義的化學(xué)計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)處理方法，對(duì)不同遺傳背景下的6株大腸桿菌的基本代謝特征進(jìn)行了分析。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑和菌株

N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA+1%TMCS)、甲酸、乙腈、吡啶、甲醇、癸酸,均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q水處理機(jī)(MILLPORE 美國公司，密理博上海貿(mào)易有限公司)產(chǎn)生的高純水。

本研究使用6株不同遺傳背景的大腸桿菌，詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株

1.2 主要儀器

GC-MS QP2010，日本Shimadzu公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；Biofuge stratos高速冷凍離心機(jī)，德國Kendro公司； LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技；真空冷凍干燥機(jī)FREEZONE4.5，美國Labconco公司。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

葡萄糖培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基，其主要成分為葡萄糖(1.0 g/L)，蛋白胨(10.0 g/L)，牛肉粉(3.0 g/L)和氯化鈉(5.0 g/L)。果糖培養(yǎng)基以同濃度果糖代替培養(yǎng)基中的葡萄糖，其余成分不變。121 ℃高壓滅菌后，兩種碳源分別以0.22 μm無菌濾膜過濾后以濾液形式加入。培養(yǎng)條件為37 ℃恒溫通氣搖床(160 r/min)培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞干重測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液離心所得沉淀，用生理鹽水洗凈后在60～100 ℃的烘箱中烘干5 h，稱重至恒重(g)，即為細(xì)胞干重(g)。

1.5 樣品處理方法及GC-MS分析方法

在樣品處理和淬滅中，快速操作對(duì)得到精確的代謝物濃度非常重要，因?yàn)楹芏啻x反應(yīng)變化都很迅速[12]。因此在對(duì)數(shù)期將菌液離心并涂于平板上生長(zhǎng)2～3 h后，取一定量菌體，放到盛有1.5 mL -20 ℃酸乙腈溶液的器皿內(nèi)，同時(shí)加入70 μL 內(nèi)標(biāo)溶液癸酸(1 g/L),而后離心吸取上清液1 mL放入冷凍干燥機(jī)中凍干。在凍干后的胞內(nèi)代謝物中加入吡啶50 μL，超生10 min溶解后，再加入BSTFA+1%TMCS60 μL，75 ℃水浴45 min。104r/min離心10 min后取上清用于GC-MS分析。定量結(jié)果以內(nèi)標(biāo)[13]及細(xì)胞干重進(jìn)行歸一化。

色譜條件：色譜柱，DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm) (J&W, USA)；進(jìn)樣1 μL，分流比10∶1，70 ℃ (5 min)―5 ℃/min―280 ℃ (5 min)，載氣體積流量,He 1.19 mL/min；MS, 進(jìn)樣口280 ℃，離子源200 ℃，傳輸線280 ℃;離子掃描,m/z33～550，溶劑延遲6 min；檢測(cè)電壓0.9 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源條件下變化最顯著代謝物的確定

分別在葡萄糖和果糖為唯一碳源培養(yǎng)條件下,對(duì)6株大腸桿菌的代謝情況進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。經(jīng)XCMS軟件分析，分別提取出2 002和1 687個(gè)有效碎片離子信息。相應(yīng)信息經(jīng)由NIST庫和標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證分別得到35和24種胞內(nèi)化合物相對(duì)穩(wěn)定的定性組分，雖然這些化合物在不同條件下都有一定程度的濃度波動(dòng)，但是，應(yīng)該有一種化合物表現(xiàn)為在同一培養(yǎng)條件下、不同菌株之間的濃度變化是最顯著的。為了分別找到在葡萄糖和果糖培養(yǎng)條件下胞內(nèi)最顯著變化的化合物，作者采用了Tusher等[14]提出的微矩陣顯著性分析策略(Significance Analysis of Microarrays ，簡(jiǎn)稱SAM分析)，結(jié)果表明在葡萄糖為唯一碳源條件下，最顯著變化的胞內(nèi)代謝物是谷氨酰胺，而果糖條件下則是尸胺(圖1、2)。

圖1 葡萄糖碳源條件下最顯著變化化合物的SAM分析結(jié)果

圖2 果糖碳源條件下最顯著變化化合物的SAM分析結(jié)果

2.2 不同碳源條件下相關(guān)系數(shù)較大代謝物的確定

由于微生物細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)發(fā)生在一個(gè)龐大的互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)中，因此，一種代謝物的濃度改變必然會(huì)引起其他一些相關(guān)代謝物的濃度變化，這些代謝物的協(xié)同變化特征則主導(dǎo)了微生物的表型特征，因?yàn)榇x特征被認(rèn)為是最接近于生物表型的反應(yīng)[13]。為了尋找這部分代謝物，作者又以所發(fā)現(xiàn)的最顯著變化的代謝物(谷氨酰胺、尸胺)為中心，分別與同條件下檢出的其他代謝物進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，其中相關(guān)系數(shù)大于0.6的代謝物(表2)被篩選出來，這些化合物再進(jìn)行聚類分析。

表2 不同碳源條件下相關(guān)系數(shù)大于0.6的化合物

2.3 不同碳源條件下聚類分析結(jié)果

不同碳源條件下聚類分析結(jié)果見圖3、4。從圖3、4上方聚類線由內(nèi)向外觀察可以發(fā)現(xiàn)，6株菌的主體聚類特征比較相似，即無論在何種碳源條件下，菌株arcA、Y和SA都具有相似的聚類特征，而其他3株菌的特征都與這3株菌比較遠(yuǎn)。

大多情況下遺傳特征決定著代謝特征，因此

化合物均經(jīng)NIST庫檢索，*為同時(shí)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證

化合物均經(jīng)NIST庫檢索，*為同時(shí)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證

在葡萄糖培養(yǎng)條件下具有相似代謝特征的菌株，在果糖條件下也應(yīng)具有類似的代謝特征。在這3株菌中，arcA基因是與氧供給有關(guān)，在該實(shí)驗(yàn)中氧氣供給充足，所以基因并未發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，生長(zhǎng)特性與野生株相差不大，而SA菌株在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，它有著與arcA較為相似的生長(zhǎng)特性。因此至少從arcA、Y和SA這3個(gè)樣品來說，本研究中對(duì)代謝指紋分析數(shù)據(jù)的處理是恰當(dāng)而準(zhǔn)確的,結(jié)合了生物學(xué)特征的數(shù)據(jù)處理過程，還降低了最終參數(shù)的個(gè)數(shù)。其他3株菌聚類特征之間的差異，可能是由其遺傳特征的特異性改變所致，作者的前期工作結(jié)果也一定程度上提示了環(huán)境因素對(duì)表型的決定作用。

3 結(jié) 論

本研究初步證實(shí)了結(jié)合一定生物學(xué)意義的代謝指紋數(shù)據(jù)處理技術(shù)可以相對(duì)有效地提取出有價(jià)值的信息，利用該方法能在一定程度上避免其他非相關(guān)因素對(duì)代謝指紋數(shù)據(jù)的影響，如果能在更大量的不同菌株測(cè)試的基礎(chǔ)上對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證和調(diào)整，將使代謝指紋分析數(shù)據(jù)得到更合理的應(yīng)用。

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