趙麗娟, 郭 敏

(懷化學(xué)院11生命科學(xué)系; 2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 31湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南懷化 418008)

黃斑姜中期染色體CPD染色和45S rDNA熒光原位雜交分析

趙麗娟1,2,3, 郭 敏1

(懷化學(xué)院11生命科學(xué)系; 2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 31湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南懷化 418008)

為了對(duì)黃斑姜(Zingiber flavo-maculatumS1Q1T ong1)的染色體進(jìn)行識(shí)別并對(duì)該物種基因組的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究,利用PI和DAPI組合(CPD)染色和45S rDNA探針熒光原位雜交對(duì)中期染色體進(jìn)行了分析.結(jié)果顯示,黃斑姜具有2對(duì)45S rDNA位點(diǎn),分別位于第3、4號(hào)染色體的短臂,對(duì)應(yīng)于相應(yīng)染色體上的顯著的CPD帶區(qū)1基于rDNA位點(diǎn)和染色體測(cè)量數(shù)據(jù),建立了黃斑姜的準(zhǔn)確而詳細(xì)的分子細(xì)胞遺傳學(xué)核型.黃斑姜核型公式為2n=2X=22= 12m+6sm+4st(SAT),其核型不對(duì)稱(chēng)性為2B型.

黃斑姜; 核型; CPD染色; 45S rDNA; 熒光原位雜交

黃斑姜(Zingiber flavo-maculatumS1Q1T ong)為姜科(Zingiberaceae)姜屬(ZingiberBoehm1)植物.我國(guó)現(xiàn)有的黃斑姜大都產(chǎn)云南南部的勐臘、景洪[1];生于海拔580—1 500米的常綠闊葉林下,花期7—8月,果期9—12月.迄今為止,對(duì)黃斑姜的研究大多是形態(tài)學(xué)、栽培技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用等方面[2-3],核型分析、DNA物理定位和基因組結(jié)構(gòu)分析的報(bào)道很少,因此對(duì)其進(jìn)行分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究十分必要.

本研究取新生根尖分生區(qū)作為材料,采用去壁低滲火焰干燥制片法[4]制備形態(tài)良好的有絲分裂中期染色體,并采用改良的CPD染色技術(shù)和45S rDNA熒光原位雜交技術(shù)對(duì)黃斑姜的染色體進(jìn)行分析,為識(shí)別黃斑姜的染色體提供新的標(biāo)記,并結(jié)合染色體常規(guī)測(cè)量,建立其分子細(xì)胞遺傳學(xué)核型.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

供試材料黃斑姜(Zingiber flavo-maculatumS1Q1T ong),由中科院昆明植物研究所黃老師提供1

45S rDNA探針來(lái)自番茄基因組,由美國(guó)Nebraska大學(xué)Arumuganathan教授提供145S rDNA片段長(zhǎng)度為911 kb,包括518S,18S和25S亞單位和非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)(IGS),克隆載體為pUC18,酶切位點(diǎn)為K pn I.

有絲分裂染色體用根尖按Song等[4]的方法制備1將黃斑姜置于沙土中于溫室中培養(yǎng),待根長(zhǎng)到1～115 cm時(shí)剪取根尖,用α—溴代萘室溫下處理1 h1用甲醇:冰醋酸(3:1)于4℃固定過(guò)夜1固定的根尖水洗后用1%的纖維素酶(CellulaseRS)、1%的果膠酶(Pectolyase Y23)及1%的蝸牛酶(Cytohelicase)的混合液(用檸檬酸緩沖液配制,pH 4.5)于28℃酶解6 h.火焰干燥法制片.染色體制片置-20℃貯存?zhèn)溆?

CPD染色參照佘朝文等的方法進(jìn)行[5].觀察在Olympus BX60熒光顯微鏡下進(jìn)行,用紫外光濾色片(UV)觀察DAPI染色,用綠色激發(fā)濾色片(WG)觀察PI染色.利用冷凝CCD照相系統(tǒng)(Cool SNAP EZ, Photomatrics)和MetMorph軟件拍攝和合成照片1

熒光原位雜交在已進(jìn)行CPD的染色體裝片上進(jìn)行.原位雜交和信號(hào)檢測(cè)按佘朝文的方法[5]進(jìn)行.染色體用DAPI復(fù)染,用Olympus BX60熒光顯微鏡觀察染色體和雜交信號(hào),用冷凝CCD照相系統(tǒng)(Cool SNAP EZ, Photomatrics)和MetMorph軟件拍攝和合成照片1

圖片處理和染色體測(cè)量使用Adobe Photoshop軟件進(jìn)行,核型分析參照李懋學(xué)和陳瑞陽(yáng)[6]的方法進(jìn)行1

2 結(jié)果

黃斑姜染色體經(jīng)CPD染色后,有兩對(duì)染色體出現(xiàn)了顯著的紅色CPD帶紋(圖1A,白色箭頭所示),說(shuō)明該染色體區(qū)段為GC豐富區(qū)[5],通過(guò)觀察多個(gè)分裂相發(fā)現(xiàn),這兩對(duì)染色體具有隨體,CPD帶位于短臂的次縊痕近端一側(cè).相繼的45S rDNA FISH顯示,黃斑姜具有2對(duì)45S rDNA位點(diǎn)(圖1B,白色箭頭所指綠色信號(hào)),對(duì)應(yīng)于相應(yīng)染色體上的顯著的CPD帶區(qū),而且CPD帶和FISH信號(hào)的大小和強(qiáng)度上也是對(duì)應(yīng)的.

圖1 黃斑姜染色體的CPD顯帶(A)、45S rDNA熒光原位雜交(B)、核型(C)和核型模式圖(D)

表1 黃斑姜的核型分析參數(shù)表

基于CPD帶和45SrDNA FISH信號(hào),結(jié)合常規(guī)的染色體測(cè)量(表1),對(duì)黃斑姜的染色體進(jìn)行區(qū)分、配對(duì),建立了體現(xiàn)它們?nèi)旧w基本形態(tài)特征、CPD帶及45S rDNA位點(diǎn)分布情況的分子細(xì)胞遺傳學(xué)核型(圖1C).核型分析結(jié)果表明,顯著的CPD帶和對(duì)應(yīng)的45S rDNA雜交信號(hào)分別位于第3、4對(duì)染色體的短臂.黃斑姜的核型公式為2n=2x=22=12m+6sm+4st(SAT).根據(jù)染色體長(zhǎng)度進(jìn)行分類(lèi)的方法[6,7],最長(zhǎng)和最短染色體的比值是2.25,臂比大于2的染色體的比例為0.27,因此核型不對(duì)稱(chēng)性屬2B型.核型模式圖見(jiàn)圖1D1

3 討 論

本研究中采用了CPD染色對(duì)黃斑姜的染色體進(jìn)行分析.CPD染色能夠精確的顯示植物基因組的GC豐富的45S rDNA位點(diǎn)[5].我們的結(jié)果表明,所有的45S rDNA雜交信號(hào)都出現(xiàn)在相應(yīng)染色體位置的CPD帶區(qū),說(shuō)明CPD染色能有效地對(duì)45S rDNA進(jìn)行物理定位.黃斑姜與在大麥、四棱豆、番茄等物種上檢測(cè)到非rDNA CPD帶不同[8],其CPD帶只專(zhuān)一地顯現(xiàn)在核仁組織區(qū)(NOR).

已有的研究報(bào)道了姜屬的其他種植物的染色體數(shù)目[9,10],但并沒(méi)有進(jìn)行核型分析.已報(bào)道的姜屬植物的染色體都為2n=22[9,10]1Mahautyh(1970)認(rèn)為姜科植物姜屬的染色體基數(shù)為11,而且?guī)缀跞嵌扼w[11]1我們的結(jié)果顯示黃斑姜也是二倍體,其染色體為2n=22,其染色體基數(shù)也為11.

我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)黃斑姜染色體的45S rDNA位點(diǎn)進(jìn)行了FISH定位,明確其具有2對(duì)45S rDNA位點(diǎn)145S rDNA FISH不僅能夠準(zhǔn)確識(shí)別植物的rDNA位點(diǎn),而且其雜交信號(hào)還可以作為標(biāo)記用于核型分析中染色體的精確識(shí)別,而且通過(guò)同一屬不同物種的45S rDNA比較定位分析,還以探討物種間的進(jìn)化關(guān)系[12].因此我們的研究對(duì)進(jìn)一步從分子細(xì)胞遺傳學(xué)水平研究姜屬的基因組及物種間的進(jìn)化關(guān)系具有重要意義.

姜屬植物的細(xì)胞遺傳研究材料常取自室外培養(yǎng)的植物,較難獲得理想的染色體裝片,這也是姜屬植物染色體研究進(jìn)展緩慢的原因之一1本實(shí)驗(yàn)的染色體制備方法對(duì)其他姜屬植物的細(xì)胞遺傳學(xué)研究也具有重要的參考價(jià)值1

[1]傅立國(guó),等.中國(guó)高等植物[M].青島:青島出版社, 2003:390～394.

[2]冉懋雄,包駿.貴州苗族醫(yī)藥研究與開(kāi)發(fā)[M].貴陽(yáng):貴州科學(xué)技術(shù)出版社,1999:164.

[3]謝建光,等.姜科植物的引種[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2000,8(4):282-290.

[4]Song YC,Liu LH,Ding Y,Tian XB,Yao Q,Meng L,et al.Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae,Hereditas,1994,121:31-38.

[5]She C W,Liu J Y,Song Y C.CPD staining:an effective technique fordetection ofNORsand otherGC-rich chromosomal regions in plants.Biotechnic&Histochemistry, 2006,81(1):13-21.

[6]李懋學(xué),陳瑞陽(yáng).關(guān)于植物核型分析的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題[J].武漢植物研究,1985,3(4):297-302.

[7]Stebbins G L.Chromosomal evolution in higher plants[M]. London:Edward Arnold,1971:85-104.

[8]佘朝文,宋運(yùn)淳.植物45S rDNA的染色體位置的CPD染色和FISH分析[J].廣西植物,2008,28(4):515-520.

[9]李維秀,陳進(jìn).十種姜科植物的染色體數(shù)目研究[J].廣西植物,2008,28(5):596-598.

[10]陳瑞陽(yáng),等.中國(guó)主要經(jīng)濟(jì)植物基因組染色體圖譜(第二冊(cè))[M].北京:科學(xué)出版社,2003:313-316.

[11]Mahautyh K.A cytological study of the Zingiberales with special reference to their taxonomy[J].Cytologia,1970, 35:13-49.

[12]佘朝文,宋運(yùn)淳.植物熒光原位雜交技術(shù)的發(fā)展及其在植物基因組分析中的應(yīng)用.武漢植物學(xué)研究[J]. 2006,24(4):365-376.

Abstract:In order to identify the chromosomes ofZingiber flavo-maculatumS.Q.T ong.and reveal preliminarily the genome organization,CPD(combined PI and DAPI)staining and FISH with 45S rDNA probe were applied to analyze the mitotic metaphase chromosomes.Two pairs of 45S rDNA sites were detected on the short arms of the chromosome 3 and 4,respectively, corresponding to the prominent red CPD bands.The molecular cytogenetic karyotypesofZingiberflavo-maculatumwas constructed based on the data of rDNA and chromosome measurements.The karyotype formula is 2n=2X=22=12m+6sm+4st(SAT)and the karyotype asymmetry belongs to 2B type.

Key words:Zingiber flavo-maculatum; karyotype; CPD staining; 45S rDNA; fluorescence in situ hybridization(FISH)

Analysis of Mitotic Metaphase Chromosomes ofZingiber flavo-maculatum using CPD Staining and FISH with 45S rDNA Probe

ZHAO Li-juan1,2,3, G UO Min1
(1.Department of Life Sciences; 2.Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province;
31Key Laboratory of Xiangxi Medicinal Plants and Ethnobotany of Hunan Higher Education,Huaihua University,Huaihua,Hunan 418008)

Q343

A

1671-9743(2011)02-0045-03

2011-02-10

湖南省教育廳一般項(xiàng)目(07C503).

趙麗娟(1979-),女,湖南溆浦人,懷化學(xué)院講師,碩士,主要研究遺傳學(xué).