徐瑜 徐偉明 周晶

(杭州師范大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院 浙江杭州 310036)

開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)[1-2]可以使實(shí)驗(yàn)室教學(xué)資源得到充分利用，學(xué)生可以運(yùn)用所學(xué)的化學(xué)知識(shí)，結(jié)合實(shí)際，自己設(shè)計(jì)課題，采用合作學(xué)習(xí)的方式解決問(wèn)題。開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)?zāi)苁箤W(xué)生得到自主探索研究的機(jī)會(huì)，對(duì)于提高學(xué)生綜合素質(zhì)、培養(yǎng)創(chuàng)新意識(shí)和實(shí)踐能力很有意義。

我們選擇了一個(gè)有教學(xué)意義、難度適宜的課題——魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的測(cè)定，作為開(kāi)放性化學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)我?；瘜W(xué)類專業(yè)學(xué)生開(kāi)設(shè)。該實(shí)驗(yàn)涉及有機(jī)化學(xué)、高分子化學(xué)、分析化學(xué)、儀器分析等課程知識(shí)以及實(shí)驗(yàn)操作的綜合應(yīng)用。

1 課題背景知識(shí)介紹

魔芋是一種草本植物，是我國(guó)的特產(chǎn)，廣泛分布于長(zhǎng)江流域。魔芋球莖中含有葡甘露聚糖(KGM)、淀粉、生物堿、纖維素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，其中KGM是一種優(yōu)良的低熱量、低脂肪、高纖維素的水溶性膳食纖維。許多研究表明，KGM具有降血糖、降血脂及逆轉(zhuǎn)脂肪肝、通便減肥、抗癌、增強(qiáng)免疫功能、抗衰老等[3]保健作用和醫(yī)療功效。魔芋葡甘露聚糖有獨(dú)特的理化性質(zhì)和一些優(yōu)良的特性，如強(qiáng)吸水性、可食用性、流變性、增稠性、凝膠性和成膜性，在制藥工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

魔芋葡甘露聚糖是已知植物膠中黏度最大的天然高分子多糖，其分子式為(C6H10O6)n。對(duì)KGM化學(xué)結(jié)構(gòu)研究的有關(guān)報(bào)道很多，但其確切結(jié)構(gòu)至今尚無(wú)定論，奧山典生等人推測(cè)它的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 KGM的推測(cè)結(jié)構(gòu)

2 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

有多種用于評(píng)價(jià)魔芋精粉和相應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量的方法；KGM含量是評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)。KGM含量的測(cè)定方法有很多種，有費(fèi)林滴定法、3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)、甘露糖膠重量法、苯酚比色法、旋轉(zhuǎn)黏度法、薄層色譜法、氣相色譜法[4]和高效液相色譜法，每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。根據(jù)這一情況，可讓學(xué)生查找相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)自己的知識(shí)水平和興趣，選擇一種或幾種測(cè)定方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和比較；然后采用小組討論的形式探討是否可行；再由教師把關(guān)，逐一進(jìn)行評(píng)價(jià)；最后制定出最佳實(shí)驗(yàn)方案。這一過(guò)程有助于開(kāi)闊學(xué)生的思維，培養(yǎng)學(xué)生比較辨別的能力。高年級(jí)的學(xué)生還可對(duì)所用測(cè)定方法中不同因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的作用和影響進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。

2.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作

學(xué)生選擇某種測(cè)定方法后，根據(jù)文獻(xiàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用化學(xué)藥品、試劑和儀器，其中遇到如氣相色譜儀、液相色譜儀、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)等大型儀器時(shí)，還需進(jìn)一步學(xué)習(xí)和鞏固這些儀器的實(shí)驗(yàn)原理和操作方法。

2.2 樣品的預(yù)處理

樣品的預(yù)處理即KGM的提取方法有好幾種：酸性冷溶法、酶解法、沸水溶解法、乙醇沉淀法、超聲波提取法、甲酸-氫氧化鈉緩沖液溶脹法等。每種提取方法都有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，學(xué)生可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件和實(shí)驗(yàn)時(shí)間選擇感興趣的方法。

2.3 實(shí)驗(yàn)操作

選擇好樣品測(cè)定方法和預(yù)處理方式后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

2.3.1 3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)[5-6]

選擇甲酸-氫氧化鈉緩沖液溶脹法提取KGM，制作標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液的曲線，確定最大吸收波長(zhǎng)，制備KGM水解液，選擇一定的顯色時(shí)間、DNS添加量、水解酸度和水解時(shí)間等因素進(jìn)行檢測(cè)，按下式算出KGM的含量：

式中w(KGM)為KGM的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(下同);ε為甘露糖和葡萄糖在葡甘露聚糖分子中的殘基分子量與葡甘露聚糖水解后得到的甘露糖和葡萄糖相對(duì)分子質(zhì)量之比；T樣為水解液的吸光度值；T白為空白樣的吸光度值；m為魔芋粉樣品質(zhì)量。

2.3.2 高效液相色譜法[7]

選擇超聲波提取法來(lái)提取KGM，制作含葡萄糖、甘露糖均為0.1mmol/L標(biāo)準(zhǔn)混合液的工作曲線，制備KGM水解液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行操作，衍生化后采用反相高效液相色譜法，分段梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，按下式計(jì)算KGM含量：

式中mM為樣品中甘露糖質(zhì)量；mG為樣品中葡萄糖質(zhì)量；m為樣品魔芋精粉的質(zhì)量。

2.3.3 甘露糖腙重量法[8]

選擇酸性水解法提取KGM，冷卻后過(guò)濾，收集濾液，調(diào)節(jié)pH至3.0，加苯肼混合，室溫條件下靜置18～20h，用已干燥至恒重(m1)的定量濾紙過(guò)濾，洗滌沉淀及濾紙，將帶有沉淀的濾紙烘干至恒重(m2)，按下式計(jì)算KGM含量：

式中m為樣品質(zhì)量；m1為干燥濾紙質(zhì)量；m2為干燥沉淀和濾紙的總質(zhì)量；1.0351為由甘露糖到葡甘聚糖的換算系數(shù)。

2.3.4 苯酚比色法[9]

選擇乙醇沉淀法提取KGM，繪制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液的曲線，配制KGM樣品液，加入6.0%苯酚試劑，于冰水浴中加適量濃硫酸，冷卻后于490.0nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，按下式計(jì)算KGM含量：

式中ε為多糖的校正系數(shù)；ρ1為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品質(zhì)量濃度；ρ2為加入樣品的質(zhì)量濃度。

2.4 結(jié)果分析

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)操作，學(xué)生可以感受到整個(gè)科學(xué)研究的過(guò)程，對(duì)不同的測(cè)定方法得到的結(jié)果進(jìn)行分析和比較，總結(jié)出最佳的實(shí)驗(yàn)條件；還可進(jìn)一步進(jìn)行放大試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、重現(xiàn)性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)等，分析誤差產(chǎn)生的原因和操作的關(guān)鍵，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)。

2.4.1 DNS比色法

DNS比色法的測(cè)定原理是：魔芋葡甘露聚糖水解后生成甘露糖和葡萄糖兩種還原糖，3,5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后生成棕色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量同反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系，利用比色法可測(cè)定魔芋中葡甘露聚糖的含量。

在KGM的提取方法上要說(shuō)明以下幾點(diǎn)：1) 常規(guī)水提法的不足之處是魔芋粉水溶脹后，溶液較渾濁，顆粒多且破碎不完全，導(dǎo)致KGM不能完全溶出，KGM含量測(cè)定值偏低，提取時(shí)間長(zhǎng)；2) 超聲波提取法利用超聲波具有的機(jī)械振動(dòng)能、熱學(xué)性能和強(qiáng)大的空化效應(yīng)，用超聲波清洗器在除去魔芋精粉中的游離還原糖后，超聲提取魔芋精粉中的KGM并進(jìn)行檢測(cè)，與常規(guī)水提法相比，該方法提取時(shí)間縮短，提取效率提高；3) 甲酸-氫氧化鈉緩沖液溶脹法提取效率高，簡(jiǎn)單快速，結(jié)果可靠，省去了常規(guī)法、超聲水提法中用85%乙醇除去游離還原糖的操作，通過(guò)試樣空白對(duì)照扣除，以獨(dú)特的定容方法避免了轉(zhuǎn)移過(guò)程中容器壁上附著KMG，從而使結(jié)果更加準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性高。

DNS比色法不需昂貴的大型分析儀器，操作簡(jiǎn)便，容易上手，但此法中氨基化合物的吸光度隨時(shí)間的變化而變化，必須使葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色反應(yīng)后存放時(shí)間與樣品溶液的顯色反應(yīng)后存放時(shí)間一致，以減少因顯色反應(yīng)后存放時(shí)間不同而造成的分析誤差；另外此法不能得出KGM分子中甘露糖和葡萄糖的物質(zhì)的量比。

2.4.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法首先測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)混合液中甘露糖和葡萄糖這兩種單糖間的校正因子，把樣品中甘露糖和葡萄糖的峰面積與內(nèi)標(biāo)物鼠李糖峰面積的比值分別代入各自的線性回歸方程，求得各自的量，再經(jīng)計(jì)算得樣品的KGM含量與兩種單糖的比例。

該方法分離效率高，分析快速，定量準(zhǔn)確，檢測(cè)時(shí)間較短，準(zhǔn)確度較高，能同時(shí)測(cè)定KGM含量及其單糖組成。但儀器昂貴，所需試劑比其他方法偏貴，實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜。

2.4.3 甘露糖腙重量法

甘露糖腙重量法的原理是甘露糖與苯肼反應(yīng)，生成甘露糖腙，而葡萄糖對(duì)甘露糖與苯肼反應(yīng)沒(méi)有影響，甘露糖在葡甘露聚糖中以一定比例存在，只要葡甘露聚糖徹底水解，就可以準(zhǔn)確測(cè)出甘露糖的含量，通過(guò)換算能夠得到KGM的含量。

此法不受淀粉、纖維素及其他可溶性糖的影響，沒(méi)有溶脹及分離雜質(zhì)的麻煩，但分析過(guò)程中被分析組分易損失，誤差大。

2.4.4 苯酚比色法

苯酚比色法的測(cè)定原理是：先用50%乙醇浸泡，離心，除去單糖、雙糖、低聚糖、苷類、生物堿等干擾成分，然后用水提取其中所含的可溶性多糖，多糖類成分在濃硫酸作用下，水解生成單糖，再與苯酚縮合生成黃色化合物，顏色深淺與糖的濃度成正比，從而可求得KGM含量。此法與DNS比色法類似。

該方法測(cè)定KGM含量簡(jiǎn)單快速，穩(wěn)定性好，易操作，原料簡(jiǎn)單價(jià)廉，但操作要仔細(xì)，否則令結(jié)果偏低，標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液的濃度需合理配制，吸光度需控制在一定范圍內(nèi)。

2.4.5 開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐與分析

我們發(fā)現(xiàn)最初學(xué)生得到這個(gè)課題后根本不知道該從哪里下手，只是像平時(shí)一樣，期待教師把具體的實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)步驟明明白白地寫(xiě)下來(lái)再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)指導(dǎo)教師講解如何進(jìn)行文獻(xiàn)檢索及如何確定實(shí)驗(yàn)方案的演示，學(xué)生能逐漸進(jìn)入到研究狀態(tài)，自己尋找感興趣的實(shí)驗(yàn)方法并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不理解的和有疑問(wèn)的地方能主動(dòng)探討，學(xué)生的積極性和熱情較高。

在這個(gè)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)學(xué)生最容易掌握甘露糖腙重量法，但初期實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差較大；對(duì)于DNS比色法和苯酚比色法，學(xué)生掌握的難易情況次之，主要是對(duì)試劑的預(yù)處理不夠好，數(shù)據(jù)處理和計(jì)算公式的推導(dǎo)不熟練；較難掌握的一種方法是高效液相色譜法，由于涉及到大型儀器高效液相色譜儀，對(duì)實(shí)驗(yàn)原理的理解和實(shí)驗(yàn)操作都有一定的困難。學(xué)生采用這些方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)是要先準(zhǔn)確掌握各種實(shí)驗(yàn)方法的測(cè)定原理，這樣在后面的實(shí)驗(yàn)操作中才能做到胸有成竹。

通過(guò)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)，學(xué)生不僅系統(tǒng)查閱文獻(xiàn)的能力得到顯著提高，而且通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)的多次重復(fù)，從實(shí)驗(yàn)原理分析誤差的來(lái)源，實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力也大有提高；另外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)學(xué)習(xí)超聲波清洗器、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、高效液相色譜儀等大型儀器的使用，培養(yǎng)了學(xué)生綜合運(yùn)用多門(mén)化學(xué)課程的相關(guān)知識(shí)的能力；最后，同學(xué)之間還可以通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和影響因素的分析、比較，在學(xué)會(huì)體會(huì)實(shí)驗(yàn)方法的多樣性帶來(lái)樂(lè)趣的同時(shí)，掌握科學(xué)研究的嚴(yán)謹(jǐn)性。

3 結(jié)語(yǔ)

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)各種意外情況，教師要及時(shí)作必要的指導(dǎo)和調(diào)整。開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)突出了學(xué)生的主體地位，這種模式對(duì)提高學(xué)生的創(chuàng)新能力和綜合能力是非常重要的。

參 考 文 獻(xiàn)

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