葉生梅，高威

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000)

細(xì)菌芽胞染色方法改進(jìn)研究

葉生梅，高威

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000)

改進(jìn)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教材上介紹的Schaeffer-Fulton氏芽胞染色法。將涂片的初染用水浴蒸汽加熱和烘箱加熱，通過(guò)顯微鏡觀察不同溫度下不同染色時(shí)間的染色效果。以5%孔雀綠為染色劑，100℃蒸汽加熱4 min或80℃蒸汽加熱6 min能達(dá)到好的染色效果。改進(jìn)方法操作簡(jiǎn)單易行，加熱過(guò)程不需添加染料，更符合環(huán)保要求;將改進(jìn)的染色方法運(yùn)用于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，收到了良好的教學(xué)效果。

細(xì)菌;芽胞染色;改進(jìn)

芽胞是某些細(xì)菌(主要是芽胞桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌)生長(zhǎng)到一定階段形成的一種抗逆性很強(qiáng)的休眠體結(jié)構(gòu)，也被稱(chēng)為內(nèi)生孢子。是否產(chǎn)生芽胞及芽胞的形狀、著生部位、芽胞囊是否膨大等是細(xì)菌分類(lèi)的主要指標(biāo)［1］。芽胞染色是細(xì)菌分類(lèi)的重要指標(biāo)，是本科院校開(kāi)設(shè)微生物課的專(zhuān)業(yè)學(xué)生必須熟練掌握的微生物染色技術(shù)，現(xiàn)有的微生物實(shí)驗(yàn)教材上介紹的染色方法是Schaeffer-Fulton氏染色法或改良的Schaeffer-Fulton氏染色法［2-6］。我們?cè)谝酝膶?shí)驗(yàn)教學(xué)中采用Schaeffer-Fulton氏法染色效果較好，但存在以下問(wèn)題:①加熱過(guò)程溫度無(wú)法控制，操作中易使涂片干涸，需反復(fù)多次補(bǔ)加染料，染色后涂片上有染料結(jié)晶，且因染料使用多造成較多染料廢水污染環(huán)境;②用夾子夾住載玻片操作，在酒精燈或電爐上加熱過(guò)程中，如果夾子控制不好，就易將染料灑到酒精燈、電爐、實(shí)驗(yàn)臺(tái)甚至學(xué)生的衣服上。改良的Schaeffer-Fulton法使用高濃度菌懸液滴加染料，沸水浴加熱染色15～20 min，學(xué)生制片時(shí)涂片上菌體少，由于加熱時(shí)間長(zhǎng)，可能對(duì)芽胞囊和菌體結(jié)構(gòu)有影響，復(fù)染時(shí)芽胞囊和菌體著色淺，實(shí)驗(yàn)效果不理想。鑒于Schaeffer-Fulton氏染色和改良的Schaeffer-Fulton氏染色存在的問(wèn)題，有一些學(xué)者對(duì)此進(jìn)行過(guò)改進(jìn)研究［7］:如將涂片的初染放在銅板上，用酒精燈加熱。本研究將涂片的初染用水浴蒸汽加熱染色和烘箱干熱染色(溫度可以控制的條件下)，通過(guò)觀察不同溫度下不同染色時(shí)間的染色效果，優(yōu)化篩選最佳的加熱方法、合適的溫度和適宜的加熱時(shí)間，試圖改進(jìn)現(xiàn)有的芽胞染色方法，使芽胞染色操作簡(jiǎn)單易行同時(shí)又減少染料廢水的排放。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis);從土壤中分離的芽胞桿菌菌株5株(編號(hào)為JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4、JZ-5)，未鑒定，均為本室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.1.3 染色劑5%孔雀綠水溶液、2.5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液。

1.1.4 儀器設(shè)備HH-6型電熱恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;DSX-280B型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠; PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;DHG-9143BS-Ⅲ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;YLE-21DV顯微影像分析系統(tǒng)(主要技術(shù)參數(shù):1130萬(wàn)像素?cái)?shù)碼CCD、數(shù)據(jù)分析軟件、YLD顯微數(shù)碼影像分析軟件、最高分辨率1280×1024)，北京亞力恩機(jī)電技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 芽胞染色操作步驟取37℃培養(yǎng)24 h的斜面菌種，常規(guī)涂片、干燥、固定—染色(初染)—水洗—復(fù)染(番紅染色2 min)—水洗—鏡檢(涂片干燥后油鏡觀察并顯微攝像)。

1.2.2 芽胞染色初染的加熱方法按常規(guī)方法制作一系列涂片，涂片上滴加3滴孔雀綠染色液，分別設(shè)置恒溫水浴鍋、烘箱溫度為40、60、80、100℃，將涂片置于各溫度下染色2、4、6、8、10 min，加熱過(guò)程中若涂片上染料快干涸時(shí)補(bǔ)加染料，觀察各溫度不同染色時(shí)間的染色效果。比較干熱和水浴蒸汽加熱染色效果，選擇適宜的加熱方法、加熱溫度、染色時(shí)間，并與Schaeffer-Fulton氏法和改良的Schaeffer-Fulton氏法比較。確定合適的染色加熱方法后將染料孔雀綠的濃度降低到2.5%染色，觀察染色效果。

2 結(jié)果與分析

2.15 %孔雀綠水浴蒸汽加熱染色與烘箱干熱染色的比較

將37℃培養(yǎng)24 h的枯草芽胞桿菌按常規(guī)制片制作涂片，分別將涂片置于40、60、80、100℃下染色，每一溫度下染色時(shí)間分別為2、4、6、8、10 min，水洗、復(fù)染，油鏡下觀察成熟的游離芽胞和形成中的芽胞著色情況，并顯微攝像。各染色效果如表1所示。

表15 %孔雀綠水浴蒸汽加熱和烘箱加熱染色效果比較Table 1The comparison of the staining effects from heating by water steam with that from heating by oven when the smear covers with 5%malachite green dye

從表1可看出，水浴蒸汽加熱染色效果明顯優(yōu)于烘箱干熱染色，80℃水浴加熱6 min，游離芽胞呈深綠色，能達(dá)到理想的染色效果，100℃染色4 min游離芽胞和形成中的芽胞深綠色，染色效果很好;而烘箱加熱染色即使100℃加熱10 min，雖然游離芽胞著色明顯，但形成中芽胞仍然著色不明顯。水浴蒸汽加熱比干熱加熱染色效果好，可能是蒸汽的穿透力強(qiáng)且有潛熱存在，染料易進(jìn)入芽胞使芽胞著色，提高了染色效果。水浴蒸汽加熱染色的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是染料不易干涸，在滴加3滴染料的情況下，80℃加熱6 min和100℃加熱4 min時(shí)染料不干涸，不需添加染料，但是烘箱干熱過(guò)程染料易干涸，需補(bǔ)加染料。部分染色顯微攝影見(jiàn)圖1。

圖1 枯草芽胞桿菌染色光鏡觀察(1000×)Fig.1Representative views of Bacillus subtilis in microscopy(1000×) a:烘箱100℃加熱10 min;b:80℃水浴蒸汽加熱6 min;c:100℃水浴蒸汽加熱4 min; d:Schaeffer-Fulton氏染色;e:改良Schaeffer-Fulton氏染色

2.2 2.5%孔雀綠水浴加熱染色效果

為節(jié)省染料、減少污染，將5%孔雀綠染料稀釋1倍作為染色液進(jìn)行系列染色，將37℃培養(yǎng)24 h的枯草芽胞桿菌按常規(guī)制片制作涂片，分別于80、100℃下用2.5%孔雀綠染色，染色時(shí)間分別為2、4、6、8、10 min，水洗、復(fù)染，油鏡下觀察成熟的游離芽胞和形成中的芽胞著色情況，各染色效果如表2所示。由表2可見(jiàn)，染料的濃度對(duì)染色效果影響很大，2.5%孔雀綠染色時(shí)需要100℃染色6 min才有明顯的著色效果，100℃蒸汽加熱超過(guò)4 min時(shí)需補(bǔ)加染料，此法雖然降低染料濃度，但要補(bǔ)加染料才能著色，因而非但沒(méi)有減少染料使用量且染色效果不如5%染料。

綜上所述，5%染料80℃染色6 min、100℃染色4 min均能達(dá)到很好的染色效果，且不需補(bǔ)加染料;與Schaeffer-Fulton氏染色法比較不僅染色效果好，節(jié)約染料減少染料廢水，而且操作簡(jiǎn)單易行。綜合考慮，選擇5%孔雀綠染料80℃水浴加熱染色6 min或100℃水浴蒸汽加熱染色4 min，作為芽胞染色初染的最佳染色方法。

表22.5%孔雀綠水浴加熱染色效果Table 2The staining effect from heating by water steam when the smear covers with 2.5%malachite green dye

2.3 幾株芽胞菌株對(duì)改進(jìn)方法的染色驗(yàn)證

表3 改進(jìn)方法對(duì)5株芽胞桿菌的染色效果Table 3The staining effect of Bacillus JZ-1toJZ-5 by improved staining method

為了驗(yàn)證以上芽胞染色的改進(jìn)方法的準(zhǔn)確性，對(duì)從土壤中分離的5株芽胞桿菌(未鑒定)用改進(jìn)方法進(jìn)行染色，各菌株37℃培養(yǎng)24 h，常規(guī)涂片，100℃水浴蒸汽染色4 min后觀察各菌株的芽胞染色效果。結(jié)果表明用改進(jìn)的方法對(duì)上述幾株芽胞桿菌的染色效果良好，證明該方法結(jié)果可靠。染色效果見(jiàn)表3、顯微觀察見(jiàn)圖2。

圖2 5株芽胞菌的染色效果(光鏡，1000×)Fig.2Representative views of Bacillus JZ-1 to JZ-5 in microscopy(1000×)

3 小結(jié)

由于芽胞結(jié)構(gòu)的特殊性，其著色不僅要加大染色劑濃度，而且要加熱。用水浴蒸汽加熱染色可以用5%孔雀綠為染色劑，于100℃蒸汽加熱4 min或80℃蒸汽加熱6 min，染色效果好。與Schaeffer-Fulton氏法比較，加熱過(guò)程不需添加染料，更符合環(huán)保要求。

加熱設(shè)備可用水浴鍋或電爐等。用電爐加熱時(shí)只需將小燒杯的水加熱至沸騰，將滴有染料的涂片架在小燒杯上即可;用水浴鍋加熱時(shí)只需將滴有染料的涂片架在水浴鍋蓋孔上，染色操作簡(jiǎn)單易行。

我校微生物實(shí)驗(yàn)課面向生物工程、食品科學(xué)與工程、生物技術(shù)、環(huán)境工程4個(gè)專(zhuān)業(yè)，以往應(yīng)用Schaeffer-Fulton氏法的微生物芽胞染色實(shí)驗(yàn)課結(jié)束，不僅酒精燈、實(shí)驗(yàn)臺(tái)等沾上很多染料，涂片染色后水洗造成更多染料廢水。我們將改進(jìn)的加熱方法應(yīng)用于學(xué)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)，收到了良好的教學(xué)效果。

［1］沈萍，陳向東.微生物學(xué)［M］.北京:高等教育出版社，2006: 53-59.

［2］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:高等教育出版社，2007:76.

［3］陳金春，陳國(guó)強(qiáng).微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京:清華大學(xué)出版社，2005:72.

［4］趙斌，何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:科學(xué)出版社，2002: 42-43.

［5］楊革.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京:科學(xué)出版社，2004:22-23.

［6］唐麗杰.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社，2005:41.

［7］袁紅，倪友娣，繆利英，等.介紹一種細(xì)菌芽胞微波染色法［J］.杭州醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)，2002，23(5-6):236.

Improvement of Bacteria’s Spore Staining

YE Sheng-mei，GAO Wei
(Coll.of Biol.and Chem.Engin.，Anhui Polytechnic Uni.，Wuhu 241000)

Schaeffer-Fulton’s spore staining method introduced in microbiological experiment teaching material was improved after heating the firstly stained smear by water bath steam and oven，the staining effects at different staining temperature and time were investigated through microscopic observation.The results showed that the best staining results could be achieved with 5%malachite green dye，heating by water steam at 100℃for 4 minutes or at 80℃for 6 minutes.This improved method was easy to operate and met the environmental protection requirement since no extra dye needed during the heating process.This method was put into microbiological experimental teaching，and achieved a better teaching results.

bacteria;spore staining;improvement

Q93

B

1005－7021(2011)01－0106－04

安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2010A349)

葉生梅女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士。主要從事微生物菌種選育研究。E-mail:ysm396@sina.com

2010-11-18;

2010-12-28