龔雙軍，楊立軍，劉輝，向立波，喻大昭*

(1.湖北省農(nóng)科院植保土肥研究所湖北省重大農(nóng)作物病蟲(chóng)草害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430064;2.襄陽(yáng)市植保站，湖北襄陽(yáng)441000)

1種小麥白粉病菌DNA基因組的微量簡(jiǎn)捷提取方法

龔雙軍1，楊立軍1，劉輝2，向立波1，喻大昭1*

(1.湖北省農(nóng)科院植保土肥研究所湖北省重大農(nóng)作物病蟲(chóng)草害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430064;2.襄陽(yáng)市植保站，湖北襄陽(yáng)441000)

為了尋找適合小麥白粉菌基因組DNA微量提取的方法，分別采用改進(jìn)破壁法，液氮研磨法和溶菌酶消化法進(jìn)行破壁，提取專性寄生菌小麥白粉菌DNA。結(jié)果表明，用改進(jìn)的破壁方法，僅用3～10 mg的分生孢子粉所獲得DNA的收率為(12.23±3.46)～(40.32±5.67)ng/mg，且OD260/OD280比值為1.71～1.92之間，說(shuō)明該破壁方法獲得的DNA收率大且純度高。通過(guò)PCR反應(yīng)獲得了良好的效果。同時(shí)該方法也適用于小麥條銹菌和大麥白粉菌專性寄生菌DNA的提取。

小麥白粉病菌;DNA微量提取

小麥白粉病是小麥重要病害之一，而小麥白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)是一種活體專性寄生菌?？捎糜谔崛NA的材料幾乎僅為病葉表面的分生孢子，而分生孢子的繁殖收集耗時(shí)長(zhǎng)，工作量大，成為進(jìn)行群體研究的技術(shù)瓶頸。發(fā)展簡(jiǎn)便易行的高質(zhì)量DNA提取方法是進(jìn)行該病菌種群遺傳多樣性、分子抗藥性監(jiān)測(cè)以及病害流行預(yù)測(cè)等研究的重要保障。目前，真菌DNA的提取通常采用以冷凍干燥菌絲研磨法或酶解形成原生質(zhì)球法破解細(xì)胞壁，然后以高濃度EDTA的SDS溶液裂解細(xì)胞膜，再以酚/氯仿/異戊醇或者氯仿/異戊醇抽提，乙醇沉淀，得到高質(zhì)量DNA。一般耗時(shí)長(zhǎng)，費(fèi)用高［1-2］。以往對(duì)于小麥白粉病菌DNA提取通常和真菌DNA基因組提取方法類似。在對(duì)白粉病菌進(jìn)行分子生物學(xué)研究中，在參考和使用不同的提取方法基礎(chǔ)上［3-4］進(jìn)行改進(jìn)，探索并建立一套簡(jiǎn)便、易行、微量(3～5 mg分生孢子)的白粉病菌DNA的提取方法，同時(shí)也適合其他專性寄生菌。采用該方法獲得高分子量DNA、純度和濃度較高，PCR分析都獲得良好的效果，完全適于進(jìn)行各類分子生物學(xué)研究工作。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株培養(yǎng)及分生孢子的收集采用文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行菌種培養(yǎng)。溫室隔離培養(yǎng)至小麥第一葉完全展開(kāi)，剪取葉片中段3 cm長(zhǎng)，葉片正面朝上放在含50 μg/mL苯駢咪唑的瓊脂保鮮培養(yǎng)基上(100 mL蒸餾水+0.5 g瓊脂+3 mL 0.2%的苯駢咪唑)，在接種筒(23.5 cm×23.5 cm×100 cm)內(nèi)對(duì)上述離體葉段接種預(yù)先繁殖好的新鮮分生孢子。把處理后培養(yǎng)皿中的葉段置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)((17±1)℃，18 h光照)，待產(chǎn)生大量孢子時(shí)于超凈工作臺(tái)上收取孢子。將培養(yǎng)皿倒扣在硫酸紙上，輕輕用鑷子敲打2～3次，收集到2 mL離心管中備用。大麥白粉菌(Blumeria graminis f.sp.horde)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)董吾輩老師提供，小麥條銹菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)由中國(guó)農(nóng)科院植保所提供。

1.1.2 試劑提取液為0.35 mol/L山梨醇，0.1 mol/L Tris，0.05 mol/L EDTA(pH 7.5)，0.02 mol/L亞硫酸氫鈉;核裂解液為0.2 mol/L Tris，0.05 mol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl，2%(質(zhì)量與體積比)CTAB。

1.2 方法

1.2.1 改進(jìn)CTAB法稱取白粉病菌的分生孢子粉3、5和10 mg，置于2 mL的離心管中，加入300 μL提取液，300 μL核裂解液，7粒直徑為5 mm的玻璃珠(Sigma公司，貨號(hào)18406);漩渦振蕩器上震蕩3、5、7和10 min后加入1 μL濃度為20 mg/mL的蛋白酶K;再加入120 μL 20%SDS;65℃水浴1 h;冷卻后加入720 μL(氯仿/異戊醇，24∶1)抽提，上下溫和顛倒20次;加1 μL RNAse(10 mg/mL)，于37℃水浴10 min。平衡后12000 r/min離心10 min;取400 μL上清液;加入40 μL 3 mol/L NaAc (pH 8.0)和800 μL無(wú)水乙醇，沉淀1 h;12000 r/min離心10 min;棄上清，沉淀加600 μL 75%乙醇洗滌，將沉淀干燥。40 μL無(wú)菌水溶解;取1 μL于0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)λ-HindⅢdigest DNA Marker 5 μL作對(duì)照。以標(biāo)準(zhǔn)濃度的DNA marker作對(duì)比，直觀比較DNA濃度、DNA降解和RNA殘存情況。用同樣方法提取大麥白粉菌(B.graminis f.sp.horde)、小麥條銹菌(P.striiformis f.sp.tritici)2種專性寄生菌的DNA。

1.2.2 與其他破壁方法的比較分別以酶法［6］和液氮研磨法［7］提取總DNA。其中酶法步驟如下:用700 μL TE緩沖液重懸沉淀，加入300 μL溶菌酶(50 mg/mL)，37℃溫育1 h。加1 μL濃度為20 mg/mL蛋白酶K和60 μL 20%SDS，65℃溫育30 min，12000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，以酚-氯仿法抽提［8］。同時(shí)以3、5和10 mg的分生孢子粉震蕩3 min作為對(duì)照，按照1.2.1方法進(jìn)行提取DNA。

1.2.3 總DNA濃度、純度和產(chǎn)量的測(cè)定用紫外吸收光譜法［9］定量測(cè)定產(chǎn)物DNA的濃度和純度A260/A280比值，確定DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量。

1.2.4 PCR擴(kuò)增對(duì)1.2.1方法提取的20個(gè)DNA樣品擴(kuò)增aox基因，擴(kuò)增引物為AOX361F/ 589R，PCR反應(yīng)的條件和體系參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 分生孢子DNA的提取

提取的小麥白粉菌DNA在0.8%的瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測(cè)見(jiàn)圖1，總DNA大小都在23.1 kb以上，在所設(shè)定的3、5和10 mg孢子質(zhì)量均可提取到DNA，且隨著孢子質(zhì)量和震蕩時(shí)間的增加，DNA樣品的濃度增高，根據(jù)點(diǎn)樣量為1 μL的50 ng/μL λ-HindⅢdigest DNA Marker分子量標(biāo)準(zhǔn)估算出提取DNA的產(chǎn)量可穩(wěn)定在15～40 ng/mg分生孢子。采用該方法用非常微量(3 mg)分生孢子震蕩破壁10 min也可以提取到較好的DNA樣品(圖1)，考慮到工作的效率建議震蕩破壁時(shí)間為3 min。

2.2 與其他破壁方法的比較

采用液氮研磨和酶解破壁法與上述方法進(jìn)行DNA提取效果比較。結(jié)果表明，液氮研磨的效果較上述方法相比，所獲得DNA樣品濃度與本方法所提取的樣品DNA濃度基本一致，但所需要的孢子量較多(表1)，然而本實(shí)驗(yàn)中采用酶解法未獲得DNA，這可能與酶解破壁所需的時(shí)間以及酶的效率有一定的關(guān)系。

2.3 PCR擴(kuò)增

如圖2所示，采用該方法在所提取的20個(gè)DNA樣品均可以擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，說(shuō)明采用該方法所提取的DNA完全可以進(jìn)行PCR等常規(guī)的分子生物學(xué)試驗(yàn)。

圖1 改進(jìn)的CTAB法提取小麥白粉病菌DNA瓊脂糖凝膠電泳圖aFig.1the effect of DNA extraction yields with modified method by agarose electrophoresis M:molecular size marker λ-HindⅢdigest DNA Marker

表1 比較不同的破壁提取法對(duì)專性寄生菌DNA濃度和純度的影響Table 1Comparison of biotrophic filamentous DNA quantity and purity from different extraction methodsa

圖2 不同DNA樣本的AOX PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2Agaros gel electrophoresls of AOX PCR products from different DNA samples 1～20:提取的DNA樣品1～20 indicated the different DNA samples

3 討論

用玻璃珠破碎細(xì)胞壁以及液氮研磨破壁法均能獲得小麥白粉病菌基因組DNA，兩者在DNA純度和產(chǎn)量上相當(dāng)，但采用改進(jìn)CTAB法與傳統(tǒng)液氮研磨破壁法的區(qū)別在于在離心管中加入玻璃珠，渦旋震蕩破解細(xì)胞壁，僅需微量的分生孢子粉，克服了過(guò)去使用研缽研磨造成的樣品浪費(fèi)和污染。而對(duì)于專性寄生菌就大大節(jié)約了擴(kuò)繁菌種時(shí)間，從而加快試驗(yàn)進(jìn)度。同時(shí)，本方法嘗試在灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的孢子懸浮液中提取DNA并獲得成功(數(shù)據(jù)未給出)。

在本實(shí)驗(yàn)中，渦旋混合器上充分混勻，是獲得DNA收率的關(guān)鍵步驟。本研究表明，一般專性寄生菌的分生孢子量在10 mg左右渦旋震蕩3 min即可獲得較好的破壁效果，如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易造成DNA降解，反之破壁不充分使核酸得不到充分的釋放。以改進(jìn)CTAB法獲得高分子量DNA純度高，可直接用PCR常規(guī)分子生物學(xué)工作，并獲得了良好的試驗(yàn)結(jié)果。專性寄生菌DNA提取方法的改進(jìn)為下一步開(kāi)展小麥白粉病菌單核苷酸點(diǎn)突變(SNP)的種群研究提供幫助。

致謝:對(duì)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程給予幫助的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)本科實(shí)習(xí)生韓容等同學(xué)表示感謝!

［1］Specht CA，Dirusso CC，Novontny CP，et al.A method for extracting high-molecular-weight deoxynucleic acid from fungi［J］.Anal Biochem，1982，119(1):158-163.

［2］Carber R C，Yodar O C.Isolation of DNA from filamentous fungi and separation into nuclear，mitochondrial，ribosomal and plasmid components［J］.Anal Biochem，1983，135(2):416-422.

［3］Ristaino J B，Madritch M，Trout C L，et al.PCR Amplification of ribosomal DNA for species identification in the plant pathogen genus Phytophthora［J］.Appl Environ Microbio，1998，64 (3):948-954.

［4］Justesen AF，Ridout CJ，Hovmoller MS.The recent history of Puccinia striiformis f.sp.tritici in Denmark as revealed by disease incidence and AFLP markers［J］.Plant Pathol，2002，51 (1):13-23.

［5］楊小軍，倪漢文，楊立軍.采用孢子萌發(fā)法測(cè)定化合物對(duì)白粉病菌的生物活性［J］.植物保護(hù)，2007，33(1):75-77.

［6］Amann RI，Ludwing W，Schleifer K H，et al.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation［J］.FEMS Microbiol Review，1995，59(1):143-169.

［7］Edwards，K.，C.Johnstone，C.Thompson.A simple and rapid method for the preparation of genomic plant DNA for PCR analysis［J］.Nucleic Acids Res，1991，19(6):1349.

［8］薩姆布魯克J，弗里奇E F，曼妮阿蒂斯T著，金冬雁，黎盂楓譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京:科學(xué)出版社，1999: 200-300.

［9］奧斯伯F，金斯頓R E，塞得曼J G，等著，顏?zhàn)臃f，王海林譯.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京:科學(xué)出版社，1998:831-833.

［10］Parks R，Carbone I，Murphy Paul J.，et al.Population genetic A-nalysis of an eastern U.S.wheat powdery mildew population reveals geographic subdivision and recent common ancestry with U.K.and Israeli populations［J］.Phytopath，2009，99(7): 840-849.

Simple and Rapid Method for DNA Genome Micro-Extraction from Wheat powdery mildew(Blumeria graminis f.sp.tritici)

GONG Shuang-jun1，YANG Li-jun1，LIU Hui2，XIANG Li-bo1，YU Da-zhao1
(1.Inst.for Plant Protect’n＆Soil Sci.，Hubei Acad.of Agric.Sci.，Hubei Key Lab.of Crop Dis.，Insect Pests＆Weeds Control，Wuhan 430064; 2.Plant Protection Station，Xiangyang City，Hubei Xiangyang 441000)

Three different DNA extraction methods for wheat powdery mildew(Blumeria graminis f.sp.tritici)were adopted.They were modified cell-wall breaking method，liquid nitrogen grinding method，and lysozyme digestion method.The results showed that the recovery rate of DNA extracted with modified cell-wall breaking method was (12.23±3.46)～(40.32±5.67)ng/mg using only 3～10 mg of condia，and OD260/OD280purity ratios were 1.71～1.92 indicated that cell-wall breaking method gained greater DNA yield and purity.PCR reactions obtained also good effects.At the same time，the method was also applicable to extract DNA from wheat stripe rust and barley powdery mildew and other DNAs from autoecious parasitic fungi.

wheat powdery mildew;DNA microextraction

S4

A

1005－7021(2011)01－0024－04

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(3-15);國(guó)家小麥產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目(NYCYTX-03);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903035-09)

龔雙軍男，助理研究員。研究方向?yàn)樾←溨饕『ΨN群研究及化學(xué)防治。E-mail:gsj204@126.com

*通訊作者。Tel:027-87380681，E-mail:Dazhaoyu@china.com

2010-12-17;

2011-01-20