毛瑩，任佐華，王娜，白珍安，虞選杰，劉二明

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128)

稻曲病菌厚垣孢子壁黑色素提取方法研究

毛瑩，任佐華，王娜，白珍安，虞選杰，劉二明*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128)

探究稻曲病菌(Ustiloginoidea virens(Cooke)Takahashi)厚垣孢子壁黑色素的最佳提取方法，采用以HCl為提取劑的酸提法和以NaOH為提取劑的堿提法，對該病菌黑色和黃色2種厚垣孢子壁的黑色素進(jìn)行提取，用3因素3水平進(jìn)行正交設(shè)計試驗，結(jié)果表明以NaOH作提取劑為佳，其提取黑色素效果最佳的組合條件為3 mol/L NaOH、2 mol/L HCl、水浴溫度80℃、水浴時間120 min。

稻曲病菌;厚垣孢子壁;黑色素;提取;正交設(shè)計

稻曲病是由真菌稻綠核菌(Ustilaginoidea virens(Cooke)Takahashi)引起的水稻穗部重要病害［1］，人或動物食用了帶有稻曲病的大米或谷粒，會引起內(nèi)臟器官的病變或中毒［2］。稻曲病的侵染循環(huán)，國內(nèi)外觀點(diǎn)雖然不統(tǒng)一，但比較一致的是，稻曲病以菌核或厚垣孢子的形式越冬。厚垣孢子有3種形態(tài):黃色、黃綠色、黑色［3］。研究表明，黑色素是一種較為復(fù)雜的酚類聚合物［4］，存在于植物或微生物的細(xì)胞壁外圍，可以保護(hù)植物或微生物對抗惡劣的環(huán)境，如紫外線、極端溫度等［5］。為了研究黑色和黃色厚垣孢子壁中黑色素含量在其顏色轉(zhuǎn)化中的差異，首先必須探究適宜提取稻曲病菌厚垣孢子壁中黑色素的方法。目前為止，國內(nèi)外還沒有專門提取稻曲病菌厚垣孢子壁黑色素的報道，只有提取其他菌類黑色素的報道。提取黑色素的前提是破壞其與其他生物大分子的相互作用，有報道直接用HCl調(diào)節(jié)菌液的pH使得黑色素沉淀［6］，或用氨水、NaOH溶液作為提取溶劑［7］;有時，為了得到大量黑色素，有報道將菌體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后用NaOH溶解黑色素，再用HCl沉淀［8］。本文擬用酸、堿及相關(guān)因素開展稻曲病菌厚垣孢子壁黑色素的提取方法，以期得出提取黑色素的最佳方法和條件，為進(jìn)一步研究稻曲病菌厚垣孢子的生物學(xué)特性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 稻曲病厚垣孢子2009年9月4日于懷化市洪江市灣溪鄉(xiāng)和豐村采集兩優(yōu)396上的典型黑色和黃色稻曲病厚垣孢子，并保存于－40℃低溫冰箱中備用。

1.1.2 試劑HCl和NaOH均為國產(chǎn)分析純;黑色素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma M8631)。

1.1.3 儀器設(shè)備紫外分光光度計(UV-VIS mini1240);高速冷凍離心機(jī)(22331 hamburg);旋片式真空泵(ZXZ-1型)。

1.2 方法

1.2.1 破壁與厚垣孢子壁的提取稱取1 g稻曲球厚垣孢子粉，然后采用本課題組的液氮研磨-超聲波處理方法破壁［9］。破壁后離心(15000 r/ min，5 min)，棄上清液，再經(jīng)真空干燥(－0.1 Pa，50℃)24 h，即得厚垣孢子壁提取物。

1.2.2 破壁率的測定普通光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)觀察破壁前后厚垣孢子的形態(tài)并拍照，用血球計數(shù)板測定破壁前后完整的厚垣孢子數(shù)，計算破壁率。

a:破壁前每毫升樣品中所含孢子數(shù)

b:破壁后每毫升樣品中所含完整孢子數(shù)

1.2.3 黑色素的提?、偎崽岱?稱取0.05 g的厚垣孢子壁提取物加入10 mL濃HCl，于水浴鍋中水浴，然后用一定濃度的NaOH溶液提取，得到沉淀后再純化和洗滌。最后離心(10000 r/ min)干燥(－0.1 Pa，50℃)得提取物。根據(jù)黑色素堿溶酸沉原理，酸提法采取以HCl為提取劑，考察提取過程中的影響因素:HCl濃度(A)，水浴120 min的溫度(B)，NaOH(C);②堿提法:稱取0.05 g厚垣孢子壁提取物，加入10 mL NaOH溶液水浴，然后用HCL沉淀，再用NaOH溶液提取，得到沉淀后純化，洗滌，離心10000 r/min干燥得提取物(－0.1 Pa，50℃)。根據(jù)黑色素堿溶酸沉原理，酸提法采取以NaOH為提取劑，考察提取過程中的影響因素:HCl濃度(A)，水浴120 min的溫度(B)，NaOH(C)。

1.2.4 黑色素含量測定①黑色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:取6支刻度試管，用NaOH溶液稀釋黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，按順序加入下列溶液，即10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)黑色素溶液，依次取用NaOH溶液稀釋黑色素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于比色杯中，不足1 mL的用蒸餾水補(bǔ)充到1 mL，再于各比色杯中加入4 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，用紫外分光光度計測定OD值，繪制黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，建立Y=aX+b回歸方程(Y為OD值，X為黑色素含量，a為回歸系數(shù)，b為常數(shù));②樣品黑色素含量測定:稱取黑色素提取物0.001 g，加入10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，然后吸取1 mL溶液于最大吸收波長下比色(空白是0.1 mol/L NaOH加蒸餾水)，然后測定吸光值，根據(jù)回歸方程計算出樣品黑色素含量。

1.2.5 統(tǒng)計分析實驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析得出［10］。

表1 酸提法3因素3水平正交設(shè)計Table 1The orthogonal test of the 3 factors and 3 levels by HCl extraction

表2 堿提法3因素3水平正交設(shè)計Table 2The orthogonal test of the 3 factors and 3 levels by NaOH extraction

2 結(jié)果與分析

2.1 厚垣孢子破壁效果

用液氮研磨加超聲波處理，用光學(xué)顯微鏡觀察研磨后的厚垣孢子，再用血球計數(shù)板計算厚垣孢子的破壁率，破壁率在95%～98%，黃色厚垣孢子破壁率多達(dá)98%，黑色厚垣孢子破壁率為95%。

2.2 黑色素的紫外掃描光譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線

用NaOH溶液稀釋黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，按黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，經(jīng)紫外分光光度計測定，其最大吸收波長為217 nm。依據(jù)OD與標(biāo)準(zhǔn)黑色素含量的關(guān)系，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。OD值與黑色素含量回歸方程:Y=0.0522X+0.0069。

圖1 黑色素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard curve of melanin content

2.32 種方法測定不同顏色厚垣孢子壁黑色素效果比較

2.3.1 酸提法從表3可知，2種類型孢子壁用酸提法的3因素極差R值表現(xiàn)為C＞B＞A，說明NaOH(C)濃度對提取2種顏色厚垣孢子壁黑色素含量的影響最大，其次是水浴溫度，再次為HCl濃度。提取黑色素含量最佳的組合為1 mol/L HCl，80℃水浴120 min，1 mol/L NaOH。經(jīng)方差分析，這3個因素對提取2種顏色厚垣孢子黑色素含量的影響差異不顯著(P＞0.05)，相對而言C因素影響要大。

表3 酸提法測定2種不同顏色厚垣孢子壁黑色素含量Table 3Melanin content of 2 types of Chlamydospores wall by HCl extraction

表5 黃色厚垣孢子壁黑色素含量方差分析Table 5Variance analysis of melanin content in yellow chlamydospores wall

2.3.2 堿提法從表62種類型孢子壁用堿提法的3因素極差R值表現(xiàn)為A＞B＞C，說明NaOH作為提取劑其濃度對2種顏色厚垣孢子壁黑色素提取影響較大，其次是水浴溫度，再次為HCl濃度。方差分析結(jié)果表明，A NaOH濃度，B水浴溫度的P＜0.01，說明NaOH濃度、水浴溫度對2種顏色厚垣孢子黑色素提取影響極顯著，而C HCl濃度的0.01＜P＜0.05，說明HCl濃度對2種顏色厚垣孢子黑色素提取影響顯著。

表6 堿提法測定2種不同顏色厚垣孢子壁黑色素含量Table 6Melanin content of 2 types of Chlamydospores wall by NaOH extraction

表7 黑色厚垣孢子壁黑色素含量方差分析Table 7Variance analysis of melanin content in black chlamydospores wall

表8 黃色厚垣孢子壁黑色素含量方差分析Table 8Variance analysis of melanin content in yellow chlamydospores wall

2.3.32 種提法的比較酸提法中，2種顏色厚垣孢子壁黑色素提取效果最佳的組合為A1B2C2;堿提法中，2種顏色厚垣孢子壁黑色素提取效果最佳的組合為A3B2C1。經(jīng)方差分析，酸提法中各因素對厚垣孢子壁黑色素提取的效果影響不顯著(P＞0.05)，而堿提法中因素C(HCl濃度)對厚垣孢子壁黑色素提取效果影響顯著(P＜0.05)，而因素A(NaOH濃度)和因素B(水浴溫度)對厚垣孢子壁黑色素提取效果影響極其顯著(P＜0.01)。因此，比較2種提取方法，以堿提法為優(yōu)，其最佳的組合條件為3 mol/L NaOH，2 mol/L HCl，水浴溫度80℃，水浴時間120 min。

3 結(jié)論與討論

本研究采用了酸提法和堿提法對稻曲病菌厚垣孢子壁黑色素進(jìn)行提取，黑色素的紫外最大吸收峰在217 nm處;在2種厚垣孢子壁黑色素提取法中，以堿提法提取為好，其最佳的組合條件為:3 mol/L NaOH，2 mol/L HCl，水浴溫度80℃，水浴時間120 min。

吳堯等［8］用濃HCl從發(fā)酵培養(yǎng)的香灰菌菌絲中提取黑色素。張建萍等［11］利用黑色素堿溶酸沉的性質(zhì)提取野生BC菌株的黑色素，但他們均不是僅從細(xì)胞壁中提取黑色素。曹志艷等［12］在沸水浴中用濃HCl提取玉米大斑病菌細(xì)胞壁黑色素，效果較好。在稻曲病菌厚垣孢子壁的黑色素提取方面，迄今國內(nèi)外尚未有報道。因此，借鑒前人在其他真菌相關(guān)方面的研究，設(shè)計了酸提法和堿提法，并通過正交設(shè)計試驗，得出以堿提法為佳，可能由于厚垣孢子壁厚、結(jié)構(gòu)緊密，與真菌營養(yǎng)體菌絲差異較大，用堿提取法更為適宜［9］。本研究得出的堿提法提取稻曲病菌厚垣孢子壁黑色素簡單易行，適合在實驗室內(nèi)操作。這將為進(jìn)一步研究黑色素含量變化與厚垣孢子越冬休眠的關(guān)系提供有效的方法，亦可為其他類型真菌孢子黑色素的提取提供參考依據(jù)。

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Melanin Extraction from Chlamydospore Wall in Ustiloginoidea virens

MAO Ying，REN Zuo-hua，WANG Na，BAI Zhen-an，YU Xuan-jie，LIU Er-ming
(Coll.of Bio-Safety Sci.＆Technol.，Hunan Agric.Uni.，Changsha 410128)

HCl as an extractant for acid extraction and NaOH as an extractant for alkaline extraction were adopted to study the optimum extraction of melanin from chlamydospore wall in Ustilaginoidea virens，melanin extraction of black and yellow chlamydospore wall in U.virens and the experiment was carried out with orthogonal design using 3 factors and 3 levels.The result showed that using NaOH as the extractant was of optimal，and the optimal combination conditions was 3 mol/L NaOH，2 mol/L HCl in 80℃water bath for 120 min.

Ustiloginoidea virens;chlamydospore wall;melanin;extraction;orthogonal design

Q939.95

A

1005－7021(2011)01－0006－04

國家自然科學(xué)基金(30871615)

毛瑩女，碩士研究生。研究生方向為微生物與植物分子互作。E-mail:spingice@qq.com

*通訊作者。Tel:0731-84618163，E-mail:emliu@126.com

2010-12-09;

2011-01-10