孟莎莎，向太和，程慢成

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310036）

一種利用黃瓜苗繁殖根結(jié)線蟲(chóng)的方法

孟莎莎，向太和＊，程慢成

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310036）

為建立繁殖根結(jié)線蟲(chóng)的新方法，利用黃瓜實(shí)生苗為宿主，在透明的玻璃瓶中成功繁殖了南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，為有效分離根結(jié)線蟲(chóng)提供了一條新途徑．該方法不僅豐富了繁殖根結(jié)線蟲(chóng)的宿主，而且便于隨時(shí)觀察線蟲(chóng)侵染根形成根結(jié)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，也避免了在繁殖過(guò)程可能造成線蟲(chóng)逃逸對(duì)周?chē)寥赖奈廴締?wèn)題．

黃瓜；根結(jié)線蟲(chóng)；繁殖

根結(jié)線蟲(chóng)主要包括南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognite）、花生根結(jié)線蟲(chóng)（M．a(chǎn)renaria）、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M．javanica）和北方根結(jié)線蟲(chóng)（M．hapla）等4種．根結(jié)線蟲(chóng)對(duì)葫蘆科、茄科、豆科作物危害最為嚴(yán)重［1］．根結(jié)線蟲(chóng)的危害主要表現(xiàn)在侵染植物宿主后形成根結(jié)，造成植物根系發(fā)育受阻和腐爛，進(jìn)而導(dǎo)致植株地上部衰弱和枯死；同時(shí)，根結(jié)線蟲(chóng)的危害又加重了枯萎病、根腐病等土傳性真菌病害和部分細(xì)菌病害的發(fā)生［2］．篩選抗根結(jié)線蟲(chóng)的作物品種、鑒定抗性基因以及研究根結(jié)線蟲(chóng)的防控等都需要大量繁殖和分離根結(jié)線蟲(chóng)．目前對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的繁殖通常利用茄科植物煙草、番茄實(shí)生苗作為宿主，宿主范圍較窄［3］，為此，有學(xué)者嘗試?yán)们芽浦参锺R鈴薯作為宿主以及水培方法等來(lái)繁殖根結(jié)線蟲(chóng)［4－6］．另一方面，葫蘆科植物種群廣泛，并且普遍受到根結(jié)線蟲(chóng)的危害．黃瓜是葫蘆科的代表性作物，近年來(lái)隨著保護(hù)地、塑料大棚種植黃瓜，根結(jié)線蟲(chóng)已經(jīng)成為其毀滅性的病蟲(chóng)害［7－8］．該研究利用葫蘆科作物黃瓜作為宿主，建立了繁殖根結(jié)線蟲(chóng)的新方法．現(xiàn)將該方法報(bào)道如下．

1 試驗(yàn)材料和方法

1．1 材料

黃瓜品種中農(nóng)6號(hào)種子購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，番茄品種蘇紅2003種子購(gòu)于杭州市種子公司．南方根結(jié)線蟲(chóng)（生理小種 MIFJ1）、南方根結(jié)線蟲(chóng)（生理小種MIJS2）、花生根結(jié)線蟲(chóng)（生理小種MAJS2）、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（生理小種MJYN）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)李紅梅教授惠贈(zèng)．

1．2 黃瓜苗的生長(zhǎng)

黃瓜種子直接播種在直徑為6～8cm透明玻璃瓶中，每瓶播種1～2粒．土壤成分為蛭石∶腐植土或沙∶腐植土（1∶1），配好的土壤高溫高壓滅菌（121℃、20min）．種植的植株放入人工氣候室中，溫度20～25℃，每天適量澆水、保持濕度75%以上，12h／12h光照和黑暗交替，光強(qiáng)1200～2400Lux．生長(zhǎng)15d的黃瓜苗（2～4片真葉）用于接種繁殖根結(jié)線蟲(chóng)．

1．3 根結(jié)線蟲(chóng)卵塊的獲取

首先從番茄苗上分離根結(jié)線蟲(chóng)卵塊用于接種，具體方法是：番茄品種蘇紅2003種子在20～25℃黑暗條件下萌芽3d破白，移入直徑9～15cm的陶土盆缽中，每盆種1～2株．盆缽中的土壤和番茄苗的生長(zhǎng)條件同黃瓜．生長(zhǎng)20d的番茄苗按照常規(guī)方法［9］接種根結(jié)線蟲(chóng)．番茄苗移栽后第30天每盆澆1次100mL 1／4MS培養(yǎng)基的大量元素和微量元素．接種第50天拔出番茄苗，用自來(lái)水洗凈根部后再用解剖針挑取根上的線蟲(chóng)卵塊，放入盛有自來(lái)水的培養(yǎng)皿中．

1．4 黃瓜苗接種根結(jié)線蟲(chóng)和根結(jié)線蟲(chóng)的繁殖

生長(zhǎng)15d的黃瓜苗，使用1mL的微量進(jìn)樣槍的槍頭插入根部附近的土壤2cm左右處，形成深1～2cm的洞穴，再使用1mL微量進(jìn)樣槍吸取2～3個(gè)卵塊加入到黃瓜根部附近的洞穴中（其中使用的1mL槍頭前端剪去1cm左右），接種完成后用土壤覆蓋洞穴．接種后每天觀察根部是否有根結(jié)等特征；接種50d后拔出黃瓜根，觀察統(tǒng)計(jì)根結(jié)和卵塊數(shù)；用顯微鏡觀察分離的線蟲(chóng)，明確線蟲(chóng)繁殖的情況．

2 結(jié)果與分析

中農(nóng)6號(hào)黃瓜品種接種南方根結(jié)線蟲(chóng)（2個(gè)生理小種）、花生根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)卵塊后均成功繁殖了根結(jié)線蟲(chóng)．黃瓜接種南方根結(jié)線蟲(chóng)（2個(gè)生理小種）、花生根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)4種不同的線蟲(chóng)，最早出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)根結(jié)的時(shí)間以及形成根結(jié)的數(shù)量有一定的差異．通過(guò)透明的玻璃瓶瓶壁直接觀察，接種4種不同的根結(jié)線蟲(chóng)后在28～35d之間黃瓜根部均可見(jiàn)直徑約1mm肉眼可見(jiàn)的根結(jié)（圖1），其中最早觀察到形成根結(jié)的是南方根結(jié)線蟲(chóng)（生理小種MIJS2）（為28d），最遲觀察到形成根結(jié)的是爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（生理小種 MJYN）（為35d），而南方根結(jié)線蟲(chóng)（生理小種 MIFJ1）和花生根結(jié)線蟲(chóng)（生理小種MAJS2）形成肉眼可見(jiàn)根結(jié)的時(shí)間分別為30d和31d．形成肉眼可見(jiàn)根結(jié)的時(shí)間快慢與形成根結(jié)的數(shù)量有一定的相關(guān)性，即黃瓜接種線蟲(chóng)后肉眼觀察到根結(jié)所需要時(shí)間越早，其形成的根結(jié)數(shù)也越多；而形成肉眼可見(jiàn)根結(jié)的時(shí)間快慢與分離獲得的卵塊數(shù)以及分離獲得的線蟲(chóng)總數(shù)的多少之間無(wú)相關(guān)性．通過(guò)顯微觀察，分離獲得的根結(jié)線蟲(chóng)在不停地運(yùn)動(dòng)，具有旺盛的活力（圖2）．

圖1 黃瓜苗繁殖根結(jié)線蟲(chóng)形成根結(jié)Fig．1 Root knot induced by root－knot nematode on cucumber seedlings

此外，通過(guò)與番茄繁殖根結(jié)線蟲(chóng)的情況相比，每株黃瓜繁殖根結(jié)線蟲(chóng)所獲得的根結(jié)數(shù)、卵塊數(shù)、線蟲(chóng)總數(shù)稍少，這可能與該研究中使用的培養(yǎng)瓶的直徑較小、黃瓜根系相對(duì)于番茄要小有關(guān)．

3 結(jié) 論

危害農(nóng)作物的根結(jié)線蟲(chóng)主要包括南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)等4種，而普通的黃瓜品種對(duì)北方根結(jié)線蟲(chóng)具有抗性［10－11］．該研究利用黃瓜實(shí)生苗成功繁殖了南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，豐富了目前繁殖根結(jié)線蟲(chóng)的宿主，克服了通常利用茄科的煙草和番茄實(shí)生苗作為宿主、宿主范圍較單一的問(wèn)題．另外，研究中利用透明玻璃瓶替代通常使用的陶瓷和塑料盆缽繁殖根結(jié)線蟲(chóng)，無(wú)需拔出根部就可以方便地隨時(shí)觀察根結(jié)形成的動(dòng)態(tài)過(guò)程；并且，使用的透明玻璃瓶底部無(wú)透水孔，因此，避免了給植株澆水繁殖管理過(guò)程中可能造成線蟲(chóng)逃逸對(duì)周?chē)寥赖奈廴締?wèn)題．值得一提的是，該方法中的培養(yǎng)瓶中黃瓜苗是在光黑交替中培養(yǎng)的，由于光照可以通過(guò)透明的玻璃瓶瓶壁，因此，該研究結(jié)果也提示光照對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的繁殖和根結(jié)的形成無(wú)明顯的影響．該研究利用黃瓜實(shí)生苗成功繁殖了根結(jié)線蟲(chóng)，這為繁殖和分離根結(jié)線蟲(chóng)提供了一條新途徑，也為抗根結(jié)線蟲(chóng)作物品種的鑒定和根結(jié)線蟲(chóng)的防控研究提供有益的基礎(chǔ)．

圖2 從黃瓜根中分離獲得的南方根結(jié)線蟲(chóng)（MIJS2）Fig．2 Meloidogyne incognita （MIJS2）isolated from cucumber roots

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Abstract：In this study，root－knot nematode of Meloidogyne incognite，M．javanica and M．a(chǎn)renaria can host in cucumber seedlings for propagation in transparent glass bottles．It is a novel method for efficient separation of root－knot nematode．This method not only enriches the host of root－knot nematode reproduction，but also is convenient to observe the root－knot formation and prevent nematode from escaping to the surrounding soil．

Key words：cucumber（Cucumis sativus L．）；root－knot nematode；propagation

A Root－Knot Nematode Propagation Method Using Cucumber Seedling

MENG Sha－sha，XIANG Tai－h(huán)e，CHENG Man－cheng
（College of Life and Environmental Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）

S432．45

A

1674－232X（2011）01－0056－03

10．3969／j．issn．1674－232X．2011．01．011

2010－08－11

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y3080184）；杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20091133B07）．

孟莎莎（1986—），女，河北石家莊人，遺傳學(xué)專(zhuān)業(yè)碩士研究生，主要從事植物基因工程研究．

＊通信作者：向太和（1965—），男，安徽青陽(yáng)人，教授，主要從事植物基因工程研究．E－mail：xthcn＠163．com