尚永輝,孫家娟,劉 靜

(咸陽師范學院化學與化工系,陜西咸陽 712000）

水飛薊素與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜研究

尚永輝＊,孫家娟,劉 靜

(咸陽師范學院化學與化工系,陜西咸陽 712000）

采用同步熒光光譜技術研究了p H=7.40的 Tris-HCl緩沖體系中水飛薊素與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用以及水飛薊素對BSA構象的影響.結果表明,水飛薊素對BSA的熒光猝滅過程為靜態(tài)猝滅,結合熱力學參數(shù)△rHm= -45.21 kJ·mol-1,△rSm= -61.61 J·K-1·mol-1;據(jù)此可以推斷,水飛薊素與BSA之間主要靠氫鍵和范德華力相結合,其結合過程為自發(fā)反應過程.

水飛薊素;牛血清白蛋白;相互作用;熒光光譜

Abstract:The interaction between silymarin and bovine serum albumin(BSA)in physiological buffer solution(p H =7.40)as well as the effect of silymarin on the conformation of BSA were studied by means of synchronous fluorescence spectrometry.It was found that silymarin quenched the fluorescence of BSA via a static quenching process,with thermodynamic parameters including enthalpy change(△rHm)and entropy change(△rSm)being-45.21 kJ·mol-1and-61.61 J·K-1·mol-1,respectively.Thus it could be inferred that the interaction between silymarin and BSA was driven mainly by hydrogen bonding and Van der Waals forces,and the binding process was a spontaneous process.

Keywords:silymarin;bovine serum albumin;interaction;fluorescence spectrometry

血清白蛋白是人和動物血清中含量最豐富的一種蛋白質,各種藥物進入人體首先與血清白蛋白結合,通過血漿的存儲和運輸,到達受體部位產生藥理作用[1].從不同角度研究蛋白質與具有生物活性小分子間的相互作用對于了解藥物的作用機制具有非常重要的意義[2].熒光光譜法是目前研究生物大分子與各種小分子以及離子相互作用的重要手段之一.

水飛薊素(silymarin)屬黃酮類化合物,臨床上主要用于肝中毒,肝功能障礙的治療.近期的研究表明,水飛薊素具有抗輻射、降血脂的作用,并對8-羥基鳥噪吟造成DNA損傷而引起的腫瘤具有一定的預防和治療作用;實驗在p H=7.40的 Tris-HCl緩沖介質中運用熒光光譜技術研究了水飛薊素與BSA的相互作用,并對其作用機理進行了初步分析.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

RF-5301型熒光分光光度計 (日本,島津公司);TB-85型恒溫水浴(日本,島津公司);p HSJ-4A p H計(上海雷磁儀器廠).

牛血清白蛋白(Amresco 0930,分子量65 000),水飛薊素(中國藥品生物制品檢定所),p H=7.40的Tris-HCl緩沖溶液.Tris、HCl為分析純,水為雙重蒸餾水.

以 Tris-HCl緩沖溶液為溶劑分別配制濃度均為1.0×10-3mol·L-1的BSA標準溶液和水飛薊素標準溶液,兩種標準溶液都在0～4℃的冰箱中保存.實驗所需濃度的溶液由此標準溶液稀釋而得.

1.2 實驗方法

在10 mL比色管中依次加入p H=7.40的 Tris-HCl緩沖溶液2.0 mL、1.0×10-3mol·L-1BSA溶液0.1 mL以及一定量的水飛薊素溶液,采用雙重蒸餾水稀釋至刻線,搖勻,在實驗溫度下恒溫1 h.采用1 cm石英比色皿,以285 nm為激發(fā)波長,繪制300～500 nm的熒光光譜和Δ λ=60 nm,Δ λ=15 nm的同步熒光光譜,測定中入射狹縫,出射狹縫寬度均為3 nm.

2 結果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

圖1 水飛薊素對BSA熒光光譜的影響Fig.1 Fluorescence spectra of silymarin-BSA

按照1.2方法分別研究了295 K,303 K,310 K,315 K溫度下水飛薊素對BSA的熒光猝滅光譜.310 K的熒光光譜見圖1.

由圖1可知:隨著水飛薊素濃度的增加,BSA的熒光強度逐漸降低,熒光發(fā)射峰逐漸紅移(由340 nm紅移至352 nm).這是由于BSA中存在的色氨酸和酪氨酸殘基,使其具有一定的內源熒光,加入的水飛薊素與BSA之間的相互作用導致BSA內源熒光強度有規(guī)律地降低.

2.2 熒光猝滅機理及猝滅常數(shù)的測定

引起B(yǎng)SA熒光猝滅的原因有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種.二種猝滅過程均遵從Stern-Volmer方程[2],隨溫度的升高動態(tài)猝滅常數(shù)逐漸增大,靜態(tài)猝滅常數(shù)逐漸減小,可由此判斷熒光猝滅的類型.不同溫度下水飛薊素對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程及猝滅常數(shù)見表1.

表1 不同溫度下水飛薊素對BSA的Stern-Volmer方程及猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constant at different temperatures

由表1可知,隨溫度升高猝滅常數(shù) Kq逐漸減小,表明水飛薊素對BSA的熒光猝滅過程屬于靜態(tài)猝滅過程.此外,各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù) Kq為2×1010L·mol-1·s-1[3],實驗中的四個溫度下水飛薊素對BSA的 Kq大于該值,進一步判斷水飛薊素對BSA的熒光猝滅過程是以靜態(tài)猝滅為主.

2.3 牛血清白蛋白與水飛薊素結合反應的熱力學性質及作用力

分子間的作用力包括氫鍵,范德華力,靜電引力,疏水作用力等,根據(jù)文獻[3]計算得到水飛薊素與BSA結合作用的熱力學參數(shù):焓變△rHm為-45.21 kJ·mol-1,熵變△rSm為-61.61 J·K-1·mol-1,自由能變△rGm為-26.11 kJ·mol-1(310 K)和-25.80 kJ·mol-1(315 K).根據(jù)Ross[4]等總結出的判斷生物大分子與小分子結合力性質的熱力學規(guī)律,由△rHm<0和△rSm<0推斷水飛薊素與BSA之間結合過程以氫鍵和范德華力為主.自由能變△rGm<0表明該過程為自發(fā)過程.

2.4 水飛薊素與BSA的表觀結合常數(shù) Kb以及結合位點數(shù)n

當小分子與大分子結合時其表觀結合常數(shù) Kb與結合位點數(shù)n由下式求出[5]:

分別繪制不同溫度下水飛薊素與BSA的lg(F0-F)/F～lgQ的雙對數(shù)圖,根據(jù)截距和斜率求得相應的Kb和 n,見表 2.

表2 水飛薊素與BSA的表觀結合常數(shù) Kb以及結合位點數(shù) nTable 2 The binding constantsKband the binding numbersnof silymarin-BSA at different temperatures

由表2可知,水飛薊素與BSA的結合位點數(shù) n接近1,表明水飛薊素與BSA可形成一個結合位點,結合常數(shù) Kb值在104數(shù)量級以上,表明水飛薊素與BSA之間有較強的結合作用,水飛薊素可以被蛋白質運輸和儲存.

2.5 同步熒光光譜

Δ λ=15 nm和Δ λ=60 nm的同步熒光光譜分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征[6].芳香氨基酸殘基的最大發(fā)射波長與其所處環(huán)境極性有關,由發(fā)射波長的改變可判斷BSA中芳香氨基酸殘基所處微環(huán)境的變化.固定BSA濃度為0.1×10-4mol·L-1,逐步改變水飛薊素的濃度,繪制Δ λ=15 nm和Δ λ=60 nm的同步熒光光譜,發(fā)現(xiàn):酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光強度均隨水飛薊素濃度的增加而產生猝滅,酪氨酸殘基的熒光發(fā)射峰藍移,色氨酸熒光發(fā)射峰紅移,表明酪氨酸殘基所處的微環(huán)境疏水性增加,親水性降低;而色氨酸殘基所處的微環(huán)境疏水性降低,親水性增加[6].

3 結論

在p H為7.40的Tris-HCl緩沖體系中采用熒光光譜技術研究了水飛薊素與BSA的相互作用.結果表明:水飛薊素對BSA的熒光猝滅過程屬靜態(tài)猝滅,結合過程是靠氫鍵和范德華力相結合的自發(fā)反應過程,應用同步熒光光譜考察了水飛薊素對BSA構象的影響.

[1]胡艷軍,劉義,侯安新.稀土雜多酸鹽EuHSiMo10W2O40·25H2O與BSA相互作用的研究[J].化學學報,2004,62(16):1519-1523.

[2]安道利,李建晴,智慧.燦爛綠與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].分析科學學報,2008,24(3):311-314.

[3]CYRIL L,EARL J K,SPERRY W M.Biochemists Handbook[M].London:Epon Led Press,1961:84.

[4]ROSS P D,SUBRAMANIAN S.Thermodynamics of protein association reactions:forces contributing to stability[J].Biochemistry,1981,20(11):3096-3102.

[5]LAKOWICZJ R,WEBER G.Quenching of fluorescence by oxygen.Probe for structural fluctuations in macromolecules[J].Biochemistry,1973,12(21):4161-4170.

[6]杜秀蓮,李榮昌,王夔.用同步熒光光譜法研究鋱(Ⅲ)與脫鐵運鐵蛋白的作用[J].科學通報,2001,46(5):394-396.

Fluorescence spectrometric study of interaction between silymarin and bovine serum albumin

SHANG Yong-hui＊,SUN Jia-juan,LIU Jing

(Department of Chemistry&Chemical Engineering,Xianyang Normal College,Xianyang712000,Shaanxi,China)

O 657.39

A

1008-1011(2011)02-0001-03

2010-11-13.

國家自然科學基金項目(20975081),西北大學研究生交叉學科資助項目(07YJC09),陜西省教育廳科研計劃項目(2010J K899).

尚永輝(1978-),男,博士生,講師,研究方向為藥物分析.