邢麗紅, 孫偉紅, 苗鈞魁, 譚志軍, 翟毓秀, 冷凱良

（中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071）

三聚氰胺在大菱鲆體內的代謝消除規(guī)律研究

邢麗紅, 孫偉紅, 苗鈞魁, 譚志軍, 翟毓秀, 冷凱良

（中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071）

采用LC-MS/MS法研究三聚氰胺在大菱鲆（Scophthalmus maximus）體內的代謝消除規(guī)律。三聚氰胺以5 g/kg濃度添加到飼料中, 連續(xù)投喂大菱鲆30 d, 停藥后, 對大菱鲆肌肉、肝臟、腎臟組織殘留的三聚氰胺進行測定。結果表明: 三聚氰胺能夠在大菱鲆肌肉、肝臟、腎臟各組織中富集并消除, 最高血藥濃度由高到低依次為Cmax肝臟＞Cmax腎臟＞Cmax肌肉, 藥時曲線下面積 AUC肝臟＞AUC腎臟＞AUC肌肉, 三聚氰胺在腎臟中消除最快, 肝臟次之, 肌肉最慢。停止給藥30 d后, 肌肉中三聚氰胺的含量降至檢出限以下。建議在本實驗條件下, 三聚氰胺在肌肉中的代謝周期為40 d。

大菱鲆（Scophthalmus maximus）; 三聚氰胺; 代謝; 消除

2007年 3月以來, 美國相繼發(fā)生多起貓狗死亡事件, 美國食品藥品管理局（FDA）調查發(fā)現(xiàn), 寵物食品使用的小麥蛋白粉和大米蛋白粉中含有的三聚氰胺是導致寵物致死的原因, 2008年9月國內繼而又發(fā)生了三鹿奶粉事件, 引起了國內外對三聚氰胺的高度關注。

三聚氰胺簡稱三胺, 是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料, 其結構中含有多個氨基氮, 添加到動、植物蛋白制品中可以提高表觀氮含量或以凱氏定氮法所測的蛋白質含量。關于三聚氰胺的檢測方法, 目前主要有氣相色譜法[1]、氣相色譜-質譜法[2-3]、高效液相色譜法[4-5]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[6-9]。液相色譜串聯(lián)質譜法不但具有較高的靈敏度, 又不需要衍生,操作較簡便, 可作為理想的確證方法而得到廣泛應用。

關于三聚氰胺的研究, 在檢測方法、藥理毒理學方面均有相關報道[10-13], 目前已有三聚氰胺在雞、雞蛋和豬體內的代謝消除規(guī)律研究[14-16], 但三聚氰胺在水生生物體內的藥代動力學方面的報道卻很少。本文通過在飼料中添加一定濃度的三聚氰胺, 采用液相色譜-串聯(lián)質譜法測定三聚氰胺的殘留量, 研究其在大菱鲆體內的代謝過程, 為防范三聚氰胺殘留提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

三聚氰胺標準品（純度≥99.5%, 美國 Sigma 公司）; 氘代三聚氰胺（100 μg/mL, 美國 Sigma公司）;三聚氰胺原藥、三氯乙酸、氨水、乙酸銨（均為分析純）; 二氯甲烷、乙腈、甲醇（均為分析純）; Oasis MCX固相萃取柱（60 mg, 3 mL）。

1.2 儀器

Thermo TSQ Quantum Access 液相色譜-串聯(lián)質譜儀, 高速離心機, 超聲波清洗儀, 氮吹儀, 固相萃取裝置, 旋渦振蕩器等。

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱: CAPCELL PAK CR （2.0 ×150 mm, SCX:C18=1 : 4, 5 μm）; 進樣量: 10 μL; 柱溫: 室溫; 流動相: 20 mmol/L乙酸銨: 乙腈=1 : 1（V/V）, 用乙酸調至pH=3.0; 流速: 0.2 mL/min。

1.2.2 質譜條件

離子化模式: 大氣壓電噴霧離子源（ESI）, 正離子模式; 噴霧電壓: 4 500 V; 鞘氣壓力: 12 L/min; 輔助氣流量: 2 L/min; 離子傳輸毛細管溫度: 350 ℃;源內碰撞誘導解離電壓: 6 V; 掃描模式: 選擇反應監(jiān)測（SRM）, 選擇反應監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量見表1。Q1半峰寬: 0.7 Da; Q3半峰寬: 0.7 Da; 碰撞氣壓力: 氬氣, 1.5 mTorr。

表1 三聚氰胺的質譜條件Tab. 1 ESI MS/MS set up for melamine analysis

1.3 試驗動物

健康大菱鲆（Scophthalmus maximus）, 平均體質量 0.05 kg, 試驗前檢測表明大菱鲆各組織中無三聚氰胺殘留。試驗前將大菱鲆暫養(yǎng)于清潔、充氣和循環(huán)海水的養(yǎng)殖桶內, 試驗期間溫度控制在16℃±3 ℃,每日投喂新鮮、不含任何藥物的飼料。

1.4 三聚氰胺藥代動力學和殘留實驗給藥方法

實驗前將大菱鲆隨機分為對照組和實驗組兩組,分別編號、稱質量記錄。實驗組三聚氰胺的添加濃度為5 g/kg, 稱取適量三聚氰胺, 將其和粉末狀飼料充分攪拌均勻, 再制成含三聚氰胺的顆粒飼料。然后將藥物飼料連續(xù)投喂 30 d, 進行三聚氰胺的富集實驗, 之后改投不含三聚氰胺的飼料, 連續(xù)投喂 40 d,進行三聚氰胺的消除實驗。在消除實驗階段, 分別在第 0、2、6、12 h 和 1、2、4、6、9、12、16、20、25、30、35、40 d, 實驗組各采樣點取6尾大菱鲆, 取其肌肉、肝臟、腎臟, 提取殘留的三聚氰胺進行測定。

1.5 三聚氰胺的提取

1.5.1 制樣

取大菱鲆肌肉、肝臟、腎臟組織, 切成不大于0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm 的小塊, 充分勻漿, 備用。

1.5.2 提取

準確稱取肌肉2 g（精確到0.01 g）, 加入10 mg/L三聚氰胺內標100 μL, 加入20 mL1%三氯乙酸, 充分渦旋混合均勻, 超聲20 min, 10 000 r/min離心5 min, 將上清液過濾。取10 mL過濾后的上清液, 待凈化。

分別準確稱取肝臟、腎臟1 g（精確到0.01 g）, 加入10 mg/L三聚氰胺內標50 μL, 加入5 mL1%三氯乙酸, 5 mL乙腈, 充分渦旋混合均勻, 超聲20 min,10 000 r/min離心5 min, 取上清液于50 mL另一具塞離心管中, 加入15 mL二氯甲烷, 渦旋1 min, 5 ℃下以不低于8 000 r/min離心5 min。將上清液全部轉移到15 mL離心管中, 加入3 mL水于二氯甲烷層中,渦漩1 min, 離心, 5 ℃下以不低于8 000 r/min離心5min。將上清液合并于上述 15 mL離心管中, 渦旋混勻, 待凈化。

1.5.3 凈化

將MCX固相萃取柱預先用5 mL甲醇和5 mL水活化, 將1.5.2上清液過柱, 依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗, 抽至近干后, 用 6 mL 5%氨化甲醇洗脫,整個萃取過程流速保持每秒一滴。收集洗脫液于 10 mL離心管, 50 ℃下砂浴氮氣吹干。殘留物用1 mL流動相定容, 渦旋混合, 過 0.2 μm有機相微孔濾膜后, 進LC-MS/MS分析。

1.6 工作曲線制備

準確稱取三聚氰胺標準品 0.01 g, 用乙腈溶解并定容至10 mL, 配成1 g/L母液。將0.1 g/L氘代三聚氰胺內標儲備液用 50%乙腈水溶液稀釋 0.01 g/L中間液。將1 g/L母液三聚氰胺和氘代三聚氰胺內標溶液用 50%乙腈水溶液稀釋成三聚氰胺的濃度分別為 0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/L, 氘代三聚氰胺內標濃度為 0.5 mg/L的標準工作溶液, 進行LC-MS/MS測定。

1.7 回收率和精密度實驗

在空白大菱鲆肌肉、肝臟、腎臟中分別按照0.1、0.5、1.0 mg/kg的添加水平進行添加回收率實驗, 樣品前處理按照1.5進行, 每個添加水平6個重復。

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

采用DNS 2.0數(shù)據(jù)分析軟件對三種組織中三聚氰胺藥物濃度進行統(tǒng)計處理。

2 結果與討論

2.1 線性范圍和最低檢出限

三聚氰胺標準溶液在0.02 ～2 mg/L濃度范圍內,線性關系良好, 相關系數(shù)大于 0.99, 該方法的最低檢出限為0.02 mg/kg。

2.2 回收率與精密度

在本實驗條件下, 以0.1、0.5和1.0 mg/kg 三個水平分別測定在肌肉、肝臟和腎臟中的回收率（表2）。三個組織中的回收率在（84.6±7.4）%～（92.1±8.1）%之間, 相對標準偏差均小于15%。

表2 大菱鲆各組織回收率數(shù)據(jù)表（n=6）Tab. 2 Recoveries of melamine for muscle, liver and kidney （n=6）

2.3 三聚氰胺在大菱鲆體內的藥-時曲線（Ci-Ti）圖

大菱鲆連續(xù)投喂三聚氰胺藥餌停藥后, 采用LC-MS/MS法測定各組織中三聚氰胺的含量, 其肌肉、肝臟、腎臟中的三聚氰胺的殘留量隨時間變化的藥-時曲線圖見圖1。

圖1 三聚氰胺在各組織中的藥-時曲線圖Fig. 1 The drug concentration-time curves of melamine in muscle, liver and kidney

2.4 三聚氰胺的主要藥動學參數(shù)

DAS 2.0程序可自動計算出藥代動力學參數(shù)。表3給出了以5 g/kg濃度在飼料中添加三聚氰胺投喂大菱鲆30 d, 停藥后三聚氰胺的藥動學參數(shù)。

2.5 三聚氰胺的富集和代謝

通過前期三聚氰胺在大菱鲆體內的富集實驗發(fā)現(xiàn), 以5 g/kg添加濃度將三聚氰胺添加到飼料中, 三聚氰胺可以富集到大菱鲆體內, 但不同組織對三聚氰胺的富集能力不同, 肌肉、肝臟、腎臟中的三聚氰胺含量隨時間的延長而增大。富集30 d后, 改投不含三聚氰胺的飼料, 各組織中藥物濃度很快降低,由此表明, 各組織吸收的藥物通過代謝途徑減少。

通過在飼料中添加三聚氰胺的方式投喂大菱鲆,停藥后, 各組織中三聚氰胺的含量均較高, 且在各組織中的最高血藥濃度由高到低依次為Cmax肝臟＞Cmax腎臟＞Cmax肌肉。三聚氰胺在各組織中的含量相差很大, 在肌肉中的濃度遠低于肝臟和腎臟中的濃度,肝臟中Cmax是肌肉中的十多倍, 腎臟中的Cmax是肌肉中的大約 5倍。余曉華等[14]在研究雞體內三聚氰胺的殘留及代謝規(guī)律時, 測定了腎臟、雞肺、肝臟,雞胸肉、雞心、雞油組織, 結果發(fā)現(xiàn), 三聚氰胺在腎臟中的殘留量最高, 高于其在肝臟中的殘留量。而在豬體內三聚氰胺的殘留也表現(xiàn)出相似的規(guī)律, 即腎臟中殘留量最高[16], 與本實驗結果有些差異。

表3 三聚氰胺的主要藥動學參數(shù)（n=6）Tab. 3 The pharmacokinetic parameters of melamin in various tuibot tissues of （n=6）

藥時曲線下面積（AUC）反應藥物進入循環(huán)系統(tǒng)藥量的多少, 是一個衡量藥物在魚體內各組織器官的吸收的重要指標。三聚氰胺在大菱鲆三個組織中AUC 由高到低依次為（表 3）: AUC肝臟＞AUC腎臟＞AUC肌肉。在相同給藥劑量條件下, 各組織的AUC差別很大, 說明組織不同, 對藥物的蓄積能力有很大差別。肝臟的AUC大約是腎臟的3倍, 是肌肉的7倍, 說明肝臟對三聚氰胺的蓄積能力較強, 吸收后的藥物大部分蓄積在肝臟組織, 之后緩慢釋放到肌肉、血液等其他組織。

消除相半衰期（t1/2）反映了藥物在機體內的消除速度, 指血藥濃度消除到一半所用的時間, 是藥動學的一個重要參數(shù)。不同組織間的t1/2差異較大, 三聚氰胺在大菱鲆肌肉中的消除半衰期為 4.2 d, 在腎臟中的消除半衰期為 1.9 d, 在肝臟中的消除半衰期為 3.1 d, 可見不同組織間的三聚氰胺t1/2差異較大（表 3）, 在腎臟中消除最快, 肝臟次之, 肌肉最慢。Mast等[10]對成年雄性Fischer 344大鼠研究表明, 三聚氰胺在大鼠體內經(jīng)過第一個24 h后, 約90%以原形形式從尿中排出, 血漿消除半衰期約 2.7 h, 尿中消除半衰期約 3 h, 二者接近。用含三聚氰胺 200 mg/kg和1 000 mg/kg的飼料投喂蛋雞, 5 d后代謝均較快, 停藥 20 d后各組織中均未檢出三聚氰胺殘留[14]。用含三聚氰胺2.5、100和500 mg/kg的飼料飼喂豬, 食用組織中殘留物需要停藥10 d后才能降至0.5 mg/kg以下[16]。三聚氰胺在大菱鲆體內消除速率低于在哺乳動物體內的消除速率, 這可能與它們長期所處的較低的環(huán)境溫度有關。研究表明, 在一定溫度范圍內, 藥物的代謝強度與水溫成正比, 水溫越高, 代謝速度越快, 溫度變化 1℃, 藥物代謝速度變化10%[17]。

2.6 代謝周期

目前我國、歐盟、澳大利亞、新西蘭、加拿大等均規(guī)定嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的最大限量值為 1 mg/kg, 液態(tài)奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的最大限量值為 2.5 mg/kg, 含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的最大限量值為2.5 mg/kg。三聚氰胺在飼料中的最大殘留限量為 2 mg/kg。三聚氰胺在水生生物體內的殘留限量還沒有規(guī)定。對大菱鲆投喂三聚氰胺飼料30 d后研究其代謝情況, 三聚氰胺在大菱鲆肌肉中的殘留量30 d后降至檢測限以下, 由于肌肉是可食性組織, 為確保食品安全系數(shù)更高一些, 建議在此實驗條件下, 三聚氰胺在肌肉中的代謝周期為40 d。

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Received: Jan., 06, 2010

Key words:turbot; melamine; metabolism; elimination

Abstract:We studied the metabolism and elimination of melamine in turbots. The melamine was fed to turbot at 5 mg/kg, and the melamine retained in muscle, liver and kidney was determined. The results indicate that melamine can be accumulated and eliminated in turbot muscle, liver, and kidney. The order of maximum residues of melamine from high to low wasCmaxliver＞Cmaxkidney＞Cmaxmuscle, while the area under the curve was AUCliver＞AUCkidney＞AUCmuscle. The elimination speed of melamine in various tissues followed the order of kidney ＞ muscle ＞ liver.Thirty days post the feeding of melamine, the melamine level in muscle was below the detection limit.

（本文編輯:康亦兼）

Metabolism and elimination of melamine in turbot

XING Li-hong, SUN Wei-hong, MIAO Jun-kui, TAN Zhi-jun, ZHAI Yu-xiu, LENG Kai-liang
（Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China）

X171.5

A

1000-3096（2011）01-0066-04

2010-01-06;

2010-06-02

基本科研業(yè)務費專項資金項目（2009-CB-02）; 國家 863計劃項目（2008AA100805）

邢麗紅（1981-）, 女, 山東青島人, 主要從事水產(chǎn)品質量安全檢測及研究, 電話: 0532-85836348, E-mail: xinglh@ysfri.ac.cn; 冷凱良, 通信作者, E-mail: lengkl@ysfri.ac.cn.