劉陶陶, 王希成,2

（1. 清華大學(xué) 生命科學(xué)院, 北京 100084; 2. 清華大學(xué)生命科學(xué)院 蛋白質(zhì)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100084）

銅離子對(duì)海參精氨酸激酶活力與結(jié)構(gòu)的影響

劉陶陶1, 王希成1,2

（1. 清華大學(xué) 生命科學(xué)院, 北京 100084; 2. 清華大學(xué)生命科學(xué)院 蛋白質(zhì)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100084）

精氨酸激酶（Arginine kinase, EC2.7.3.3）是無脊椎動(dòng)物能量代謝所必需的重要的酶。海參精氨酸激酶是一種特殊的雙亞基精氨酸激酶。本文研究了在二價(jià)銅離子作用下, 海參精氨酸激酶催化活性與結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明, 一定濃度的銅離子, 可以抑制精氨酸激酶的活力, 并引起酶二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化, 引起疏水面暴露, 并導(dǎo)致酶的聚集。銅離子對(duì)精氨酸激酶的抑制作用與鎂離子等其他二價(jià)金屬離子有明顯不同。

精氨酸激酶（Arginine kinase, EC2.7.3.3）; Cu2+; 聚沉; 去折疊

磷酸原激酶是一大類酶, 能夠催化 ATP與生物體內(nèi)天然存在的一些胍基底物之間可逆的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng), 分別生成相應(yīng)的磷酸胍基化合物用以儲(chǔ)存ATP上高能磷酸鍵的能量, 多位于動(dòng)物能量消耗和能量波動(dòng)比較大的部位[1]。精氨酸激酶（Arginine kinase, EC2.7.3.3）是磷酸原激酶家族的成員之一, 精氨酸激酶是無脊椎動(dòng)物中最為廣泛存在的一種磷酸原激酶, 催化ATP與精氨酸之間γ-磷酸基團(tuán)的可逆性交換, 生成ADP和磷酸精氨酸。在組織的ATP供應(yīng)充足時(shí), 可將能量存儲(chǔ)在磷酸精氨酸的高能磷酸鍵中, 當(dāng)組織消耗大量能量時(shí), 為及時(shí)補(bǔ)充能量則催化磷酸精氨酸分解, 用以補(bǔ)償 ATP濃度的劇烈變化[2]。精氨酸激酶主要以分子質(zhì)量約為40 ku的單體形式存在, 某些棘皮動(dòng)物如海參、海膽中的精氨酸激酶為特殊的雙體結(jié)構(gòu), 分子質(zhì)量約 80 ku, 由兩個(gè)相同的亞基構(gòu)成[3]。在磷酸原激酶家族中, 對(duì)于其他物種來源的單體精氨酸激酶和存在于脊椎動(dòng)物中的肌酸激酶（Creatine kinase） 研究的較為詳盡, 而對(duì)于雙亞基海參精氨酸激酶的研究比較少。

以往對(duì)磷酸原激酶家族的研究中, 已經(jīng)證實(shí)鋅離子和銅離子等重金屬離子可以影響肌酸激酶的催化功能與結(jié)構(gòu), 并影響酶的折疊過程[4-5]。銅是生物體發(fā)揮正常生理功能所必須的微量元素, 但過量的銅離子對(duì)于機(jī)體具有毒性, 由于銅離子的氧化還原活性, 推測(cè)過量的銅對(duì)機(jī)體的損害可能有: 引起生物大分子的氧化, 導(dǎo)致蛋白質(zhì)或 DNA的損傷, 催化ROS（reactive oxygen species）的形成, 結(jié)合于蛋白質(zhì)上引起蛋白聚集等[6-8]。精氨酸激酶是海參能量代謝所必需的酶, 將它作為模式蛋白, 從生物化學(xué)的角度研究過量的銅離子對(duì)酶的抑制作用, 對(duì)于闡明酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒pET21b與大腸桿菌BL21/DE3,購于Novagen公司; ATP、精氨酸、Tris、isopropylβ-D-thiogalactopyranoside （IPTG）、1-anilinonaphtalene-8-sulfonate（ANS）, 購自 sigma公司;親和層析鎳柱 Ni2+-NTA, 購自上海申能博彩公司; 實(shí)驗(yàn)所用二價(jià)銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液用CuCl2配制, 購自Fluka;用超純水配制 30 mmol的銅離子標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)液, 采用容量瓶定容, 在實(shí)驗(yàn)中稀釋到相應(yīng)的終濃度。其他試劑都為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 酶的表達(dá)純化

編碼海參精氨酸激酶的基因已經(jīng)由本實(shí)驗(yàn)室克隆到質(zhì)粒pET21b上, 構(gòu)建了pET21b-AK載體, 可在大腸桿菌BL21/DE3中可溶性表達(dá)[9]。為了便于表達(dá)純化, 在 C末端加上 His-tag。挑取單菌落在含50μg/mL 氨芐青霉素的新鮮 LB培養(yǎng)基中經(jīng) 37℃過夜培養(yǎng), 二次培養(yǎng)轉(zhuǎn)接至同樣的LB培養(yǎng)基中待OD值達(dá)到0.6左右, 加入0.4 mmol 的IPTG （isopropylβ-D-thiogalactopyranoside） , 在25℃的條件下培養(yǎng)14 h,以誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。使用Ni2+-NTA鎳柱進(jìn)行酶的分離純化, 根據(jù)說明書進(jìn)行操作。收集菌體破碎細(xì)胞, 離心取上清液, 與鎳柱結(jié)合, 用含有梯度濃度咪唑的緩沖液洗脫蛋白。純化的蛋白經(jīng) SDS-PAGE電泳鑒定為均一的一條帶。從大腸桿菌的海參精氨酸激酶, 比活與電泳遷移率都與從海參肌肉中提取的精氨酸激酶基本一致[9]。

1.2.2 酶濃度的測(cè)定

酶濃度的測(cè)定采用 Bradford考馬斯亮藍(lán) G-250法, 以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 酶活力的測(cè)定

采用改進(jìn)的 pH比色法[10]測(cè)定精氨酸激酶的活性, 反應(yīng)體系中含有5.7 mmol精氨酸, 4.8 mmol ATP,6.6 mmol乙酸鎂, 復(fù)合酸堿指示劑（麝香草酚藍(lán)-甲基紅）, 20 mmol Tris-乙酸, pH 8.0。測(cè)定活力時(shí), 1 mL反應(yīng)液加入光徑1 cm的塑料比色杯中, 加入10 μL的精氨酸激酶啟動(dòng)反應(yīng), 測(cè)定 575 nm 處光吸收值在30 s之內(nèi)的變化?；盍y(cè)定在Specord 200 UV Vis分光光度計(jì)（Jena, 德國）上進(jìn)行。

失活動(dòng)力學(xué)常數(shù)的計(jì)算采用半對(duì)數(shù)作圖法[11],若為一級(jí)反應(yīng), 失活速率常數(shù)k可由速率方程lnA=?kt求得, 其中A代表酶活,t是失活時(shí)間。

1.2.4 光譜實(shí)驗(yàn)

遠(yuǎn)紫外CD光譜測(cè)定是在Jasco –J500C型圓二色性色譜儀上進(jìn)行, 測(cè)定波長(zhǎng)范圍為190～260 nm, 吸收池光徑為1 mm, 每個(gè)樣品掃描3次取平均值。

熒光光譜都通過熒光儀Hitachi 850 spectrofluorimeter測(cè)得。內(nèi)源熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm。掃描范圍設(shè)定300～400 nm。用ANS作為外源熒光探針,測(cè)定實(shí)驗(yàn)中樣品的疏水表面暴露情況, 將樣品與ANS按照1 : 50的摩爾比在室溫下避光作用30 min后, 進(jìn)行400～600 nm處的熒光掃描。激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為380 nm。

1.2.5 聚沉實(shí)驗(yàn)

聚集實(shí)驗(yàn)是用Specord 200 UV Vis分光光度計(jì)（Jena, 德國）于室溫下通過監(jiān)測(cè) 400 nm處吸光度的變化來反映該過程中濁度的變化。

實(shí)驗(yàn)中除特別注明, 一般酶的終濃度為10μmol/L, 緩沖液為 20 mmol/L Tris-Ac （pH 8.0）, 溫度為25℃, 反應(yīng)時(shí)間1 h。

2 結(jié)果

2.1 海參精氨酸激酶剩余活力的變化

將海參精氨酸激酶與不同濃度的 Cu2+,在 25 ℃作用1 h后測(cè)定精氨酸激酶的剩余活力。如圖1所示,低濃度的 Cu2+即可導(dǎo)致精氨酸激酶活力的迅速下降。在0～1 mmol/L濃度范圍之間, 隨著Cu2+濃度的增加, 精氨酸激酶的活力出現(xiàn)迅速的降低。當(dāng) Cu2+的濃度增加到1 mmol/L時(shí), 精氨酸激酶的剩余活力減少到只有天然狀態(tài)的 32%。當(dāng) Cu2+濃度增加到4 mmol/L時(shí), 精氨酸激酶活力繼續(xù)緩慢降低到低于天然狀態(tài)的2%, 僅有極少部分活力。從不同濃度的Cu2+對(duì)于精氨酸激酶活力影響結(jié)果可見, 二價(jià)銅離子對(duì)精氨酸激酶有明顯的活力抑制作用。而在同樣條件下同等濃度的 Mg2+、Ca2+、Mn2+等二價(jià)金屬離子則不會(huì)使精氨酸激酶出現(xiàn)失活（數(shù)據(jù)未提供）。進(jìn)一步改變不同的銅離子濃度, 監(jiān)測(cè)精氨酸激酶活力隨時(shí)間的變化過程, 可以發(fā)現(xiàn), 精氨酸激酶在 Cu2+作用下, 隨著 Cu2+濃度的升高, 精氨酸激酶失活的速度也會(huì)加快。通過不同時(shí)刻取樣, 測(cè)量酶的剩余活力,將剩余活力取對(duì)數(shù)對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖, 結(jié)果見圖2。由內(nèi)插圖可以判斷該反應(yīng)為一級(jí)動(dòng)力學(xué)雙相反應(yīng), 該過程分為快相與慢相兩部分, 分別對(duì)快相部分和慢相部分進(jìn)行線性擬合, 根據(jù)斜率可求出慢相部分的失活常數(shù)k2, 用快相減去慢相的變化可得到扣除慢相反應(yīng)后快相的失活常數(shù)k1。其中k1隨Cu2+濃度增加而增大, 而k2變化不明顯, 結(jié)果如表1所示。

圖1 不同濃度Cu2+對(duì)精氨酸激酶活力的影響Fig. 1 Effect of Cu2+on the residual activity of AK

圖2 加入Cu2+后精氨酸激酶失活隨時(shí)間變化的曲線Fig. 2 Kinetic course of AK inactivation induced by Cu2+

表1 Cu2+處理精氨酸激酶的失活動(dòng)力學(xué)Tab. 1 Inactivation rate constants of AK in the presence of Cu2+

2.2 海參精氨酸激酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

利用遠(yuǎn)紫外 CD光譜可以反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。將不同濃度的銅離子與精氨酸激酶反應(yīng)1h,然后測(cè)CD光譜。如圖3所示, 在0～3 mmol/L濃度范圍內(nèi), 隨著Cu2+濃度的增加, 222 nm和208 nm處的兩個(gè)負(fù)峰, 峰值有一定程度的下降。說明Cu2+對(duì)精氨酸激酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的影響。

內(nèi)源熒光光譜的結(jié)果（圖4）表明, 在 Cu2+的作用下, 精氨酸激酶的熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)了輕微的紅移, 從天然狀態(tài)的329 nm紅移至332.5 nm。表明Cu2+對(duì)精氨酸激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)有一定程度的影響,使精氨酸激酶的結(jié)構(gòu)變得略微松散。同時(shí), 隨著Cu2+濃度的增加, 內(nèi)源熒光的強(qiáng)度也隨之降低, Cu2+對(duì)精氨酸激酶的結(jié)合可能導(dǎo)致熒光生色基團(tuán)的疏水微環(huán)境發(fā)生了變化, 而使得熒光強(qiáng)度有所降低。

圖5是用0～3 mmol/L不同濃度的Cu2+處理精氨酸激酶。結(jié)果顯示精氨酸激酶的 ANS外源熒光強(qiáng)度明顯增高, 最大熒光發(fā)射峰位藍(lán)移, 表明在 Cu2+的作用下精氨酸激酶的疏水面暴露程度增加了, 并且隨著Cu2+的濃度增加而加大。

圖6比較了用同濃度的 Cu2+和其他幾種不同的二價(jià)金屬離子處理精氨酸激酶之后, 疏水表面的暴露程度。從圖中結(jié)果可以看出, 室溫下3 mmol/L的Cu2+的作用使得精氨酸激酶的ANS熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng), 而同樣濃度的 Mg2+、Ca2+、Mn2+則沒有引起精氨酸激酶疏水面的明顯暴露。

圖3 精氨酸激酶的圓二色光譜Fig. 3 Far-ultraviolet CD spectra of AK

圖4 精氨酸激酶的內(nèi)源熒光光譜Fig. 4 Intrinsic fluorescence emission spectra of AK.曲線1-5 Cu2+濃度與圖3相同

2.3 聚沉的結(jié)果

通過400 nm處濁度的變化來檢測(cè)Cu2+對(duì)精氨酸激酶的聚集作用。圖7是常溫下用不同濃度的Cu2+處理酶之后, 精氨酸激酶的聚集變化。結(jié)果顯示,Cu2+可以使精氨酸激酶出現(xiàn)明顯的聚集, 低于1mmol/L的 Cu2+對(duì)精氨酸激酶的聚集速度比較慢,A400nm濁度緩慢增加。高于1 mmol/L的Cu2+對(duì)精氨酸激酶的聚集作用非常顯著, 且聚集的程度隨著Cu2+濃度的增加而加劇。Cu2+對(duì)精氨酸激酶的聚集也是有濃度依賴性的, 如圖8所示, 隨著Cu2+濃度的增加精氨酸激酶聚集的更為明顯。而在同樣條件下同等濃度的 Mg2+、Ca2+、Mn2+等二價(jià)金屬離子則不會(huì)使精氨酸激酶出現(xiàn)聚集現(xiàn)象（數(shù)據(jù)未提供）。

圖5 精氨酸激酶的ANS熒光光譜Fig. 5 ANS-binding fluorescence spectra of AK

圖6 幾種不同的二價(jià)金屬離子對(duì)精氨酸激酶作用的ANS熒光光譜Fig. 6 ANS-binding fluorescence spectra of AK for different divalent ions.

3 討論

在生物學(xué)的研究中, 關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的研究一直是一個(gè)重要的核心問題。對(duì)于酶來說, 構(gòu)象的完整性以及折疊的正確與否是其發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)。以往對(duì)于酶的研究中, 利用胍、脲等變性劑對(duì)酶進(jìn)行折疊與去折疊已經(jīng)做了很多工作,但是關(guān)于金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響這方面的研究還不是很多。

圖7 不同濃度Cu2+對(duì)精氨酸激酶的聚集影響Fig. 7 Aggregation time course of AK induced by Cu2+at different concentrations.

圖8 5 mmol/L Cu2+對(duì)不同濃度精氨酸激酶的聚集影響Fig. 8 Aggregation time course of AK induced by 5 mmol/LCu2+at different concentrations of enzyme

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知, 常溫下低濃度的 Cu2+即可引起精氨酸激酶的活力迅速降低, 并隨著 Cu2+濃度的增加而持續(xù)降低, 增加 Cu2+的濃度會(huì)導(dǎo)致精氨酸激酶失活的速率也有所增加。動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明 Cu2+對(duì)精氨酸激酶的失活是雙相過程, 分為快相和慢相兩部分。CD光譜結(jié)果顯示, 隨著Cu2+濃度的增加, 峰值出現(xiàn)一定程度的下降, 證明二級(jí)結(jié)構(gòu)在 Cu2+的誘導(dǎo)下發(fā)生了變化,α-螺旋含量減少。與Cu2+對(duì)精氨酸激酶作用后剩余活力的結(jié)果相比, 在該濃度范圍內(nèi),精氨酸激酶的活力也是迅速降低的, 提示精氨酸激酶催化活力的降低是由于結(jié)構(gòu)的改變。內(nèi)源熒光的結(jié)果表明, 在 Cu2+的誘導(dǎo)下, 精氨酸激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了細(xì)微的變化, 最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)了一定程度的紅移, 并伴隨著熒光強(qiáng)度的降低。說明在Cu2+的作用下, 精氨酸激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)變得有些疏松, 熒光生色基團(tuán)所處的疏水微環(huán)境發(fā)生了變化而導(dǎo)致酶的內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降。CD和熒光的結(jié)果暗示Cu2+對(duì)精氨酸激酶的作用可能導(dǎo)致了其的部分去折疊。

ANS是一種疏水探針, 可與蛋白質(zhì)中的疏水區(qū)域結(jié)合導(dǎo)致熒光產(chǎn)率的大大增加。這一特性可以用來檢測(cè)蛋白疏水表面的暴露情況。ANS的熒光強(qiáng)度變化表明, 在 Cu2+的作用下, 精氨酸激酶表面的疏水面暴露增加, 而疏水相互作用是在蛋白折疊和再折疊過程中誘導(dǎo)聚集的主要原因。疏水面的暴露可能是導(dǎo)致Cu2+誘導(dǎo)精氨酸激酶聚集的主要原因。

在聚集的實(shí)驗(yàn)中, 在一定濃度 Cu2+作用下, 結(jié)果顯示 Cu2+誘導(dǎo)精氨酸激酶的聚集趨勢(shì)是隨著Cu2+濃度的增加而增加, 并且是酶濃度依賴性的。在無其他變性條件下, Cu2+即可導(dǎo)致精氨酸激酶出現(xiàn)疏水面的暴露, 導(dǎo)致聚集的發(fā)生。而其他幾種二價(jià)金屬離子在同樣條件下不會(huì)引起精氨酸激酶的聚集, 作為重金屬離子的 Cu2+對(duì)精氨酸激酶的抑制和誘導(dǎo)聚集的現(xiàn)象, 和 Mg2+、Ca2+、Mn2+等其他二價(jià)金屬離子不同, 這可能與Cu2+特殊的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。

本研究結(jié)果表明, 過量的 Cu2+對(duì)海參精氨酸激酶有明顯的抑制作用, 可導(dǎo)致蛋白的失活與聚集, 并干擾酶的折疊過程, 具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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Received: Jun., 25, 2010

Key words:Arginine kinase; Cu2+; aggregation; unfolding

Abstract:Arginine kinase （AK） plays an important role in the cellular energy metabolism of invertebrate. AK from sea cucumberStichopus japonicusis dimeric. The effects of Cu2+on AK were studied by measuring activity changes, kinetic time course of inactivity, far-UV circular dichroism spectra, fluorescence spectra, and turbidity changes at 400nm. These results suggested that Cu2+caused AK inactivation accompanied by conformational change, exposure of hydrophobic surface, and aggregation. The effects of Cu2+on AK are distinctive compared with other metal divalent ions.

（本文編輯:康亦兼）

Effects of Cu2+on Arginine kinase: activity changes, conformational changes, and aggregation

LIU Tao-tao1, WANG Xi-cheng1,2
（1. School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China; 2. Protein Science Laboratory of the Ministry of Education, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China）

Q518.4

A

1000-3096（2011）01-0017-05

2010-06-25;

2010-09-07

劉陶陶（1973-）, 女, 山東濟(jì)南人, 博士研究生, 主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究, 電話: 010-62783958, E-mail: liutaotao@tsinghua.org.cn; 王希成, 通信作者, 電話: 010-62783958, E-mail:wangxic@mail.tsinghua.edu.cn