高 麗，聶中標(biāo)，尚彩玲，王永輝，李艷彥，周 然

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024）

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）系衛(wèi)矛科（Celastraceae）雷公藤屬一年生藤本植物，廣泛分布于長(zhǎng)江流域以南各地及西南地區(qū)，如江西、浙江、安徽、湖南、廣東、福建、臺(tái)灣等地。藥用部位為根，具有祛風(fēng)除濕、活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)、殺蟲(chóng)止血等功效，對(duì)腎病綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎等多種疾病有較好的治療效果。但雷公藤有大毒，是近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)報(bào)道發(fā)生中毒事件最多的中藥之一。雷公藤主要有效成分為二萜內(nèi)酯類，包括雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯二醇等，其中雷公藤甲素是雷公藤的主要活性物質(zhì)及主要毒性成分，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇雷公藤總二萜內(nèi)酯作為檢測(cè)指標(biāo)，采用比色法對(duì)雷公藤藥材進(jìn)行質(zhì)量分析研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

雷公藤甲素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111567-200502），3，5-二硝基苯甲酸（化學(xué)純，中國(guó)五聯(lián)化工廠，批號(hào)：w0040711），KOH（分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20080908），層析用中性氧化鋁（100目～200目，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20091001），硅膠G薄層層析（青島譜科分離材料有限公司，批號(hào)：6006），其他試劑均為分析純。

雷公藤藥材分別采自江西、湖南、湖北、廣西、福建等地，經(jīng)山西省藥品檢驗(yàn)所高天愛(ài)研究員鑒定為衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.F.的干燥根。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

BS224S萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯），BT25S十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯），KQ-300 VDE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DL-5-B離心機(jī)（上海安亭），Cary 50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取雷公藤甲素對(duì)照品1.95 mg，置25 mL容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備［1-2］

取雷公藤粉末（過(guò)3號(hào)篩）約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入乙醇100 mL，密塞，稱定重量，放置過(guò)夜，超聲處理45 min，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，以3 000 rpm離心10 min，濃縮上清液，用中性氧化鋁拌樣，過(guò)中性氧化鋁柱（濕法裝柱，內(nèi)徑12 mm），用50 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液（40滴/min），濃縮至干，用乙醇溶解，移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 Kedde顯色劑的配制

根據(jù)文獻(xiàn)［3-4］報(bào)道及預(yù)實(shí)驗(yàn)，配制2%3，5-二硝基苯甲酸乙醇溶液和2%KOH乙醇溶液，臨用前1∶1 混合。

2.4 薄層色譜法鑒定實(shí)驗(yàn)

圖1 薄層色譜圖

按照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）實(shí)驗(yàn)，分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯（5∶3）為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%的硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，置日光下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1。供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)。

2.5 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密吸取對(duì)照品溶液2 mL，加乙醇6 mL，加Kedde顯色劑2 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，在400 nm～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明對(duì)照品的最大吸收峰在550 nm波長(zhǎng)處，故選550 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.6 穩(wěn)定性考察

精密吸取對(duì)照品溶液2 mL，加乙醇6 mL，Kedde顯色劑2 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，于550 nm波長(zhǎng)處，室溫下每隔5 min測(cè)定吸光度，考察60 min內(nèi)穩(wěn)定顯色的時(shí)間段。結(jié)果顯示15 min～30 min內(nèi)吸光度大且穩(wěn)定，故選顯色20 min進(jìn)行測(cè)定。

2.7 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液 1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加 7 mL，6 mL，5 mL，4 mL，3 mL，2 mL 乙醇，加 Kedde顯色劑 2 mL，搖勻，顯色20 min，以相應(yīng)試劑為空白，于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品的濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，其線性范圍為 7.8 μg/mL～46.8 μg/mL，回歸方程為：Y=0.022X+0.016 6，r=0.999 5。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取雷公藤粉末6份，各約10 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取2 mL，加6 mL乙醇，2 mL Kedde顯色劑，搖勻，顯色20 min，以相應(yīng)試劑為空白，于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果雷公藤中總二萜內(nèi)酯的平均含量（n=6）為0.084 8‰，RSD為1.78%。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

稱取已知含量的雷公藤粉末約5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入雷公藤甲素對(duì)照品0.38 mg，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取2 mL，加6 mL乙醇，2 mL Kedde顯色劑，搖勻，顯色20 min，以相應(yīng)試劑為空白，于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算平均加樣回收率（n=6）為96.86%，RSD為2.40%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.10 樣品含量測(cè)定

取樣品粉末（過(guò)3號(hào)篩）各3份，每份約10 g，精密稱定，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取2 mL，加6 mL乙醇，2 mL Kedde顯色劑，搖勻，顯色20 min，以相應(yīng)試劑為空白，于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雷公藤總二萜內(nèi)酯的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 雷公藤藥材中總二萜內(nèi)酯的含量測(cè)定 （n=3）

3 討 論

對(duì)于雷公藤總二萜內(nèi)酯的測(cè)定，目前普遍采用基于Kedde試劑顯色反應(yīng)原理的比色法［5］。Kedde試劑顯色反應(yīng)原理是在堿性溶液中，內(nèi)酯環(huán)上的不飽和雙鍵轉(zhuǎn)位能形成活性次甲基，形成的次甲基非?；顫姡梢院?，5-二硝基苯甲酸等試劑進(jìn)行縮合反應(yīng)，氧化生成具有醌式結(jié)構(gòu)的物質(zhì)而呈紫紅色，在可見(jiàn)光區(qū)有特征吸收峰［6］，因此本實(shí)驗(yàn)采用Kedde顯色反應(yīng)，對(duì)雷公藤中含有α，β-不飽和內(nèi)酯環(huán)的雷公藤總二萜內(nèi)酯進(jìn)行定量分析。Kedde顯色劑由3，5-二硝基苯甲酸和堿性試劑如KOH或NaOH組成。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得不同產(chǎn)地的雷公藤藥材中總二萜內(nèi)酯的含量變化較大，其中江西產(chǎn)雷公藤總二萜內(nèi)酯含量最高。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的雷公藤類口服制劑有湯劑、雷公藤片、雷公藤多苷片、雷公藤口服液、雷公藤糖漿等多種劑型，這些制劑多為原藥材的乙醇粗提物，僅有雷公藤多苷片是經(jīng)過(guò)初步提純的，質(zhì)量良莠不齊，主要有效成分和毒性成分的含量既沒(méi)有監(jiān)控也沒(méi)有測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。不同來(lái)源的雷公藤藥材質(zhì)量差異較大可能是不同廠家生產(chǎn)的雷公藤制劑中有效成分含量差異大的主要原因。因此，應(yīng)該盡快建立雷公藤及其制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控，通過(guò)對(duì)藥材種植、采收、飲片炮制、制劑生產(chǎn)等多環(huán)節(jié)控制雷公藤的毒性，同時(shí)保證藥效，以保證用藥的安全性和有效性。

［1］李琰，馮俊濤，史曉燕，等.雷公藤組培產(chǎn)物中雷公藤甲素和總生物堿含量的測(cè)定［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（3）：367-372.

［2］阮鳴，魏海婷.三批雷公藤藥材真?zhèn)蔚蔫b別及其提取方法研究［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，19（2）：143-145.

［3］施棟磊，朱華旭，潘林梅，等.雷公藤藥材中有效部位含量的比較研究［J］.中國(guó)新藥與臨床藥理，2009，20（6）：566-570.

［4］陳銀芳，徐群志，魏惠珍，等.Kedde比色法測(cè)定復(fù)方雷公藤片中總內(nèi)酯［J］.中草藥，2008，39（2）：223-225.

［5］王曉琳，黃帥.雷公藤乙酸乙酯提取物的含量測(cè)定方法［J］.齊魯藥事，2008，27（8）：471-473.

［6］姚新生，吳立軍，吳繼洲.天然藥物化學(xué)［M］.4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004.