殷建瑞，謝富華，解龍昌，高 聰

（廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣東廣州510260）

急性腦梗死后首先引起一系列炎癥反應(yīng)，釋放大量細(xì)胞因子、趨化因子、黏附因子和蛋白水解酶等，加重腦組織損傷［1］。腦內(nèi)固有免疫的激活需要TLRs、TLR4及TAK1來激活NF-κB等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，表達(dá)許多炎性細(xì)胞因子，從而加重腦缺血性損傷［2-3］。本研究通過檢測(cè)急性腦梗死患者TLR4及TAK1表達(dá)的變化探討其與炎性反應(yīng)機(jī)制的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

50例急性腦梗死病例均為我院2009年1月-2010年12月神經(jīng)內(nèi)科住院的首次發(fā)病患者，發(fā)病6 h～24 h入院，符合第4屆全國(guó)腦血管病會(huì)議修訂的急性腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT或MRI證實(shí)，平均年齡（55.37±12.48）歲。另選健康體檢者30例（均除外頸動(dòng)脈粥樣斑塊形成）作為健康對(duì)照組，平均年齡（60.12±9.37）歲。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

兩組病例均排除近4 w感染性、免疫性疾病，腫瘤，慢性阻塞性肺部疾病，外周血管性疾病，心力衰竭，心房顫動(dòng)，肝腎功能不全等。除此之外，急性腦梗死組還應(yīng)排除：①心源性腦栓塞或其他原因的腦栓塞；②復(fù)發(fā)的缺血性腦卒中；③瘤性腦卒中。

1.3 方法

所有病例均進(jìn)行常規(guī)資料登記（包括病史、生命體征、既往病史），血常規(guī)及生化檢查包括血糖、血脂、C-反應(yīng)蛋白、血白細(xì)胞、分葉細(xì)胞比例、血小板、梗死病灶大小，其中梗死灶的測(cè)定方法采用有病灶的頭顱 CT 進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算公式為（0.5×a×b×c），其中a為最大長(zhǎng)徑、b為最大橫徑、c為10 mm的梗死薄片切割值，所有的CT掃描均由神經(jīng)?？漆t(yī)師進(jìn)行雙盲評(píng)估。在入院24 h內(nèi)進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分（采用NIHSS評(píng)分系統(tǒng)）。TLR4及TAK1檢測(cè)：取血4 mL以密度梯度離心法獲取外周血白細(xì)胞，以Trizol法提取外周血白細(xì)胞，總RNA為模板，以SYBRRGREE設(shè)計(jì)引物，由上?；ど锕こ碳夹g(shù)服務(wù)有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄酶為MMLV（美國(guó)Invitrogen公司）。合成的cDNA稀釋后取適量以熒光定量PCR法進(jìn)行TLR4、TAK1及β-actin檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物取每個(gè)反應(yīng)體系6 μL，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)中分析泳帶的平均場(chǎng)密度面積值，以此值表示相應(yīng)基因的表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組間的兩兩比較通過t檢驗(yàn)分析，并應(yīng)用多元逐步回歸分析確定各研究因素對(duì)TLR4的影響。

2 結(jié)果

2.1 兩組病例一般臨床特征比較

結(jié)果見表1。由表1可以看出，健康對(duì)照組與急性腦梗死組年齡、性別、吸煙史、糖尿病病史及高血壓病史之間差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；急性腦梗死組患者血糖水平、CRP水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、入院時(shí)NIHSS評(píng)分及腦梗死容積均比健康對(duì)照組高，差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 兩組病例外周血中不同發(fā)病時(shí)間TLR4及TAK1的含量變化比較

結(jié)果見表2。由表2可以看出，急性腦梗死患者外周血中TLR4及TAK1含量隨病情變化呈增高趨勢(shì)，以發(fā)病后第12小時(shí)升高最明顯，與健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 各因素與急性腦梗死病灶容積的相關(guān)性分析

結(jié)果見表3。由表3可以看出，腦梗死病灶的容積與糖尿病史、CRP水平、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、入院時(shí)NIHSS評(píng)分均有相關(guān)性；另一方面，腦梗死病灶容積與 TAK1、TLR4（1 h）無顯著相關(guān)性，而 TLR4（12 h、24 h）的表達(dá)與腦梗死病灶的容積有相關(guān)性，同時(shí)在校正糖尿病史、CRP水平、NIHSS評(píng)分、白細(xì)胞計(jì)數(shù)影響的基礎(chǔ)上，TLR4（12 h、24 h）的表達(dá)與腦梗死病灶的容積仍存在獨(dú)立相關(guān)性。

3 討 論

腦梗死（cerebral infarction，CI）的發(fā)生及進(jìn)程涉及到炎癥反應(yīng)，本研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP、血糖水平等均較健康對(duì)照組高，且上述指標(biāo)與腦梗死的梗死灶容積成正相關(guān)，與既往研究結(jié)論相符。

表1 兩組病例一般臨床特征比較 （±s）

表1 兩組病例一般臨床特征比較 （±s）

梗死容積（CC，r）健康對(duì)照組 70.24±9.6 59.3 35.7 26.4 37.6 36.5±2.6 120.47±27.6 6.3±2.1 187.4±32.9 2.7±0.9 2.8±0.74 7.5±3.4急性腦梗死組 71.45±10.38 52.7 42.2 38.8 45.8 36.8±3.3 140.62±28.8 10.7±3.8 233.8±40.7 4.8±2.1 5.2±1.86 64.6±20.3 P 0.512 0.810 0.095 0.083 0.077 0.925 0.016 0.047 0.663 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001組別 年齡（歲）男性（%）吸煙史（%）糖尿病史（%）高血壓病史（%）體溫（℃）血糖水平（mg/dL）白細(xì)胞（×103/mL）血小板（×103/mL）CRP（mg/dL）NIHSS（入院時(shí)，分）

表2 兩組病例外周血中不同發(fā)病時(shí)間TLR4及TAK1的含量變化比較 （±s）

表2 兩組病例外周血中不同發(fā)病時(shí)間TLR4及TAK1的含量變化比較 （±s）

注：與本組 1h 比較，1）P＜0.01

組別 TLR4 TAK1 1 h 12 h 24 h 1 h 12 h 24 h急性腦梗死組 4.57±1.21 7.23±2.541） 5.88±2.071） 20.38±4.56 37.40±6.851） 34.83±5.611）健康對(duì)照組 - 1.69±0.78 - - 13.27±4.29 -

表3 各因素與急性腦梗死病灶容積的相關(guān)性分析

TLR4是細(xì)菌LPS的受體；在LPS誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用，TLR4通過協(xié)同分子CD14、LPS結(jié)合蛋白LBP和MD2的共同作用經(jīng)由MyD88、TRAF-6絲裂原活化的蛋白激酶MAPK等信號(hào)傳導(dǎo)途徑，將LPS傳導(dǎo)通路的信號(hào)迅速傳至核內(nèi)，激活核因子NF-κB通路和相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，釋放促炎性細(xì)胞因子，激活特異性免疫應(yīng)答，在機(jī)體的先天性和獲得性免疫中起重要作用［4］。近年來的研究顯示免疫系統(tǒng)的介入和多種細(xì)胞因子的大量釋放在急性腦梗死的病情演變過程中起著至關(guān)重要的作用［5］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在急性腦梗死的患者外周血可見TLR4表達(dá)明顯升高，其表達(dá)隨病情的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。同時(shí)，TLR4表達(dá)在發(fā)病12 h、24 h與腦梗死病灶的容積有相關(guān)性，經(jīng)校正糖尿病史、CRP、白細(xì)胞計(jì)數(shù)等影響因素后仍存在獨(dú)立相關(guān)性。由此說明，TLR4參與了急性腦梗死的發(fā)病過程，至少能夠成為急性腦梗死患者的一種生物標(biāo)記物。

TAK1是一種激酶，是一種參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞活動(dòng)的信號(hào)蛋白。TAK1能夠激活兩種特異性的蛋白質(zhì)——NF-κB和JNK，這兩種蛋白質(zhì)與機(jī)體免疫、炎癥、細(xì)胞程序性死亡以及癌癥的發(fā)生有關(guān)［6］。最初對(duì)TAK1的描述是在骨發(fā)育過程中，TAK1在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子beta和骨形成蛋白（BMP）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用。但研究逐漸證明，它在TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中也起著非常重要的作用。在IL-1信號(hào)傳導(dǎo)研究中顯示，TAK1與一個(gè)特殊的激活因子-TAK1結(jié)合蛋白（TAB1）共同激活 NF-κB 誘導(dǎo)激酶（NIK）和 IκB 激酶（IKK）［7］。實(shí)驗(yàn)已證明，在 TLR4 啟動(dòng)的 LPS 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，TAK1的重要作用不僅是激活NF-κB，而且通過激活p38MAPK和JNK，對(duì)MKKK具有調(diào)節(jié)作用，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程下游因子的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者TAK1含量明顯升高，然而，并沒有發(fā)現(xiàn)TAK1的含量與腦梗死的梗死容積有任何相關(guān)性。因此只能說明TAK1參與了腦梗死發(fā)病的炎癥反應(yīng)機(jī)制，作為一種新的治療靶點(diǎn)仍不明確。

總之，TLR4及TAK1在急性腦梗死發(fā)病的炎性反應(yīng)機(jī)制的病理生理過程中發(fā)揮了作用，TLR4可作為腦梗死的治療靶點(diǎn)，然而尋找新的治療藥物仍需進(jìn)一步研究。

［1］Vila N，Castillo J，Dávalos A，et al.Proinflammatory cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke［J］.Stroke，2000，31（10）：2 325-2 329.

［2］Castellanos M，Castillo J，Garc M M，et al.Inflammation mediated damage in progressing lacunar infarctions：a potential therapeutic target［J］.Stroke，2002，33（4）：982-987.

［3］DeGraba T J.The role of inflammation after acute stroke：utility of pursuing anti-adhesion molecule therapy［J］.Neurology，1998，51（S3）：62-68.

［4］Brea D，Sobrino T，Ramos-Cabrer P，et al.Inflammatory and neuroimmunomodulatory changes in acute cerebral ischemia［J］.Cerebrovasc Dis，2009，27（S1）：48-64.

［5］Cao C X，Yang Q W，Lv F L，et al.Reduced cerebral ischemia-reperfusion injury in toll-like receptor 4 deficient mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，353（2）：509-514.

［6］Caso J R，Pradillo J M，Hurtado O，et al.Toll-like receptor 4 is involved in subacute stress-induced neuroinflammation and in the worsening of experimental stroke［J］.Stroke，2008，39（4）：1 314-1 320.

［7］Di Y，Li S，Wang L，et al.Homeostatic interactions between MEKK3 and TAK1 involved in NF-kappa B signaling［J］.Cell Signal，2008，20（4）：705-713.