福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 陳建平 王根宇 鄧 穎 李建偉

戊酸乙酯是一類短鏈脂肪酸酯，無色油狀液體，呈天然水果香味，是重要的香精、香料組分。戊酸乙酯與丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯等酯類物質(zhì)同被稱為芳香酯，廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化妝品及醫(yī)藥等日常生活用品中[1]。

通常情況下, 芳香和香味成分是由化學(xué)合成或從天然來源中提取的。化學(xué)合成法通常需在高溫高壓及強酸條件下進行, 副反應(yīng)多、產(chǎn)物分離難、生產(chǎn)成本高, 且隨著脂肪酸和脂肪醇碳鏈的加長，反應(yīng)難度加大；而從植物中提取芳香物質(zhì)的量有限，無法滿足人們的需求。目前國內(nèi)外多有研究采用以脂肪酶為催化劑的方法來催化合成芳香類物質(zhì)，而其中以微生物脂肪酶為催化劑較為常見[2,3]。和化學(xué)合成法相比，酶法生物合成的芳香酯不僅被認為是高質(zhì)量的天然產(chǎn)品，而且具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、專一性好、易提取、易控制等優(yōu)點，被看成是很有希望工業(yè)化的新途徑[3,4]。酯化反應(yīng)以微生物脂肪酶作為催化劑，具有顯著特點：反應(yīng)條件比較溫和，醇用量較少, 幾乎沒有污染物排放, 產(chǎn)物易分離純化，對設(shè)備性能要求較低。因此，利用酶法酯化合成生產(chǎn)芳香酯類物質(zhì)是一種較好的選擇。本研究以國產(chǎn)堿性脂肪酶為催化劑，在不同的有機相中催化戊酸酯化合成戊酸乙酯，考察了各種因素對戊酸轉(zhuǎn)化率的影響，探討并得出了適宜的酶催化反應(yīng)條件。

1 材料與方法

1.1 脂肪酶

擴展青霉（Penicillium expansum）堿性脂肪酶：由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.2 化學(xué)試劑

橄欖油、戊酸為化學(xué)純。 其它試劑均為分析純。正辛烷、正庚烷、石油醚等有機溶劑在使用前用 3A分子篩作脫水處理。

1.3 儀器

恒溫搖床, 高速組織搗碎機，磁力攪拌器，電熱恒溫水浴鍋, 堿式滴定管，常規(guī)玻璃器皿等。

1.4 堿性脂肪酶催化合成戊酸乙酯的反應(yīng)體系的構(gòu)成

在100mL具塞三角瓶中，將0.020mol/L的戊酸、與戊酸成一定摩爾比的乙醇和15mL的有機溶劑組成非水相酯化反應(yīng)體系，加入一定量的堿性脂肪酶作為合成反應(yīng)的催化劑。在控制適當(dāng)溫度的恒溫搖床中以150 r/min的速度旋轉(zhuǎn)振蕩。間隔一定時間加入一定量的3A分子篩以移走產(chǎn)物中的部分水分。定時取樣分析檢測酶催化酯化合成反應(yīng)體系中戊酸的轉(zhuǎn)化率。

1.5 堿性脂肪酶的酶活測定

采用NaOH中和滴定法測定堿性脂肪酶的酶活[5]。

1.6 戊酸轉(zhuǎn)化率的測定

反應(yīng)一定時間后，取0.5mL樣品，加入95%乙醇10 mL，以1%酚酞為指示劑，用0.025 mol/L NaOH標準溶液滴定，并按下式計算戊酸的轉(zhuǎn)化率：

式中：α——戊酸的轉(zhuǎn)化率；

V0——反應(yīng)初始時樣品耗堿體積，mL；

V——反應(yīng)一定時間后樣品耗堿體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 戊酸與乙醇的摩爾比對酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

按1.4的方法構(gòu)建反應(yīng)體系：戊酸濃度為0.02mol/L，加入正辛烷15mL，堿性脂肪酶0.45g（相當(dāng)于840 U / g戊酸），戊酸與乙醇的摩爾比分別為1.0:1.1，1.0:1.2，1.0:1.3，1.0:1.4，1.0:1.5，1.0:1.6，在恒溫搖床中，控制反應(yīng)溫度為 36℃，反應(yīng)時間為24h。實驗結(jié)果如圖1所示。

從圖中看出：當(dāng)戊酸與乙醇的摩爾比為1.0:1.5時，戊酸的轉(zhuǎn)化率為最高。這是因為堿性脂肪酶在催化戊酸和乙醇合成戊酸乙酯的酯化反應(yīng)中，根據(jù)化學(xué)平衡原理，適當(dāng)增加反應(yīng)物乙醇的濃度可以使反應(yīng)平衡向正反應(yīng)方向移動，從而提高戊酸的轉(zhuǎn)化率。但是，由于乙醇本身也是一種酶的失活劑，當(dāng)乙醇的濃度過大時會降低酶的活性，使戊酸的轉(zhuǎn)化率下降。

圖1 底物摩爾比對戊酸轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 加入堿性脂肪酶的酶量對酯化反應(yīng)的影響

按1.4的方法構(gòu)建反應(yīng)體系：戊酸濃度為0.02mol/L，戊酸與無水乙醇的摩爾比為1.0:1.5，加入正辛烷15mL，在恒溫搖床中，控制反應(yīng)溫度為36℃，反應(yīng)時間為24h，探討不同加酶量對酯化反應(yīng)中戊酸轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果如圖2所示。可以看出，在加酶量為0.45g（相當(dāng)于840 U / g戊酸）時，戊酸的轉(zhuǎn)化率為最高，可達98%。

圖2 酶用量對戊酸轉(zhuǎn)化率的影響

2.3 不同有機溶劑對酯化反應(yīng)的影響

按1.4的方法構(gòu)建反應(yīng)體系：戊酸濃度為0.02mol/L，戊酸與無水乙醇的摩爾比為1.0:1.5，堿性脂肪酶0.45g（相當(dāng)于840 U / g戊酸），各種有機溶劑的加入量分別為15mL。在恒溫搖床中，控制反應(yīng)溫度為36℃，反應(yīng)時間為24h，探討不同有機溶劑對酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果如圖3所示。以正辛烷為有機溶劑時，戊酸的轉(zhuǎn)化率為最高。

圖3 有機溶劑對戊酸轉(zhuǎn)化率的影響

2.4 反應(yīng)溫度對酯化反應(yīng)的影響

按1.4的方法構(gòu)建反應(yīng)體系：戊酸濃度為0.02mol/L，戊酸與乙醇的摩爾比為1.0:1.5，加入堿性脂肪酶0.45g（相當(dāng)于840 U / g戊酸），加入15mL正辛烷。反應(yīng)時間為24h，探討不同反應(yīng)溫度對酯化反應(yīng)戊酸轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果如圖4所示，酯化反應(yīng)的最適宜溫度為36℃，此時戊酸轉(zhuǎn)化率可達98%。此最適宜反應(yīng)溫度與擴展青霉堿性脂肪酶的酶學(xué)特性相一致[6]。

圖4 反應(yīng)溫度對戊酸轉(zhuǎn)化率的影響

2.5 反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)的影響

按1.4的方法構(gòu)建反應(yīng)體系：戊酸濃度為0.02mol/L，戊酸與無水乙醇的摩爾比為1.0:1.5，堿性脂肪酶0.45g（相當(dāng)于840U/ g戊酸），有機溶劑為15mL的正辛烷，反應(yīng)溫度為36℃，探討不同反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)的戊酸轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果如圖5所示。從圖中看出：在24h內(nèi)，戊酸轉(zhuǎn)化率上升較快；在24h過后仍能保持較高轉(zhuǎn)化率。但從實際生產(chǎn)的經(jīng)濟性等綜合考慮，反應(yīng)時間取24h較為適宜。

圖5 反應(yīng)時間對戊酸轉(zhuǎn)化率的影響

3 結(jié)論

采用國產(chǎn)堿性脂肪酶在有機相中催化合成戊酸乙酯，通過實驗室研究以優(yōu)化酶法酯化合成條件。當(dāng)戊酸濃度為0.020mol/L時，戊酸與乙醇的摩爾比為1.0:1.5，加入脂肪酶酶量為0.45g（相當(dāng)于840U / g戊酸），在有機溶劑為正辛烷，恒溫搖床中以150 r/min的速度旋轉(zhuǎn)振蕩，反應(yīng)溫度為36℃，反應(yīng)時間為24h，并適時加入一定量的3A分子篩移走產(chǎn)物中的部分水分。在上述最佳反應(yīng)條件下進行戊酸乙酯的酯化合成反應(yīng)，戊酸的轉(zhuǎn)化率可達 98% 。由此可見國產(chǎn)擴展青霉堿性脂肪酶是一種優(yōu)異的酯化合成生物催化劑。

[1]許開天，許葵，甘毅. 酒精制品的生產(chǎn)與配方[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，1995.

[2]馬歌麗, 彭新榜, 陳海明. 微生物脂肪酶及其催化合成芳香酯研究進展[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版) ，2002, 17(3) : 50-53.

[3]陳建平，葛清秀，黃祖新. 堿性脂肪酶在正庚烷中催化合成己酸乙酯的研究[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2005,21(4) ：117-120.

[4]徐巖, 郭翔, 章克昌. 有機介質(zhì)中酶法生物轉(zhuǎn)化酒用芳香酯的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，1998，25（1）：20-24.

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[6]鄭毅，龔福生，施巧琴等. 擴展青霉脂肪酶催化性質(zhì)的研究[J]. 藥物生物技術(shù)，2000,7（2）：98-101.