張春蕾，華正宇，袁小林，楊 真，張 青，李小歡

(1.大連大學附屬中山醫(yī)院中心實驗室，遼寧大連 116001;2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，遼寧大連 116011)

一種高效的巨噬細胞體外誘導培養(yǎng)方法

張春蕾1，華正宇2，袁小林1，楊 真1，張 青1，李小歡1

(1.大連大學附屬中山醫(yī)院中心實驗室，遼寧大連 116001;2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，遼寧大連 116011)

［目的］探索一種不需要分離前體細胞和加入外源性細胞因子的巨噬細胞體外誘導培養(yǎng)方法。［方法］收集腹腔接種肝癌腹水瘤細胞的小鼠腹水細胞，37℃、5%CO2條件下不換液、不傳代體外培養(yǎng)。當培養(yǎng)細胞幾乎全部死亡時，有少量細胞的胞漿內(nèi)顆粒消失、折光性變強。此時少量換液，這些細胞的體積迅速增大、分裂增殖活躍。通過形態(tài)學觀察、免疫學標志檢查及體外吞噬功能檢測，鑒定這些細胞是巨噬細胞。［結(jié)果］本實驗獲得了高純度、高活性的巨噬細胞，具備巨噬細胞的形態(tài)特征和巨噬細胞特異的分化抗原-CD68。與不同誘導方法培養(yǎng)的巨噬細胞的吞噬能力比較，差異均有顯著性意義(P＜0.05)，表明死亡細胞誘導的巨噬細胞具有良好的吞噬能力。［結(jié)論］應用不需要分離前體細胞和加入外源性細胞因子的巨噬細胞體外誘導培養(yǎng)方法，操作簡便、經(jīng)濟實用，易于獲得足量的巨噬細胞，可廣泛應用于臨床及實驗研究。

死亡細胞;誘導;巨噬細胞;分化

巨噬細胞是機體免疫系統(tǒng)的重要細胞成分，在非特異性免疫防御及特異性免疫應答中均起十分關(guān)鍵的作用。研究與應用巨噬細胞的核心問題是如何獲得高純度、高活性的巨噬細胞，然而由于該細胞的誘導、分化及激活機制尚不十分清楚，體外誘導培養(yǎng)很困難，這對于巨噬細胞的研究與應用限制很大。本實驗室在以往研究中發(fā)現(xiàn)，死亡細胞可誘導巨噬細胞前體細胞活化增殖并分化成具有較高吞噬活性的巨噬細胞。本研究進一步完善巨噬細胞的體外培養(yǎng)方法，旨在為巨噬細胞誘導、分化及激活機制的研究提供實驗資料和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物:昆明小鼠，5～8周齡，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

瘤細胞株:小鼠肝癌細胞株(H22)腹水型，由哈爾濱醫(yī)科大學免疫學教研室提供。

主要試劑及儀器:小鼠淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)，MURINE GMCSF(PEPROTECH，INC.)，羊抗小鼠 CD68 單克隆抗體(Santa Cruz，美國)，F(xiàn)ITC標記兔抗山羊IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)，XSZ-HY1熒光顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)，OLYMPUS光學顯微鏡(日本制造)。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞紅細胞懸液的制備

于無菌條件下，自雞翼下靜脈采血5 mL，立即加入到事先加有1 mL肝素鈉(1000 U)抗凝劑的Eppendorf管中混勻，4℃保存。使用前，以無菌生理鹽水離心(2000 rpm×5 min)洗滌3次，然后用生理鹽水配成體積分數(shù)為5%的雞紅細胞懸液備用。

1.2.2 不同誘導方法培養(yǎng)的巨噬細胞的分組

PBS誘導組(P組):向小鼠腹腔內(nèi)注入冰中預冷的無菌PBS 2 mL，以刺激產(chǎn)生大量的巨噬細胞［1］。

GM-CSF誘導組(G組):分離小鼠血液單個核細胞，用含5 ng/mL GM-CSF的RPMI 1640培養(yǎng)基(含 10%FBS)置 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)［2］。

死亡細胞誘導組(D組):復蘇肝癌腹水瘤細胞(H22)，小鼠腹腔接種H22，于小鼠腹腔接種H22的第7天左右，在無菌條件下用注射器收集腹水細胞，將收集的腹水細胞加入到Eppendorf管中，離心(1000 rpm×5 min)后棄上清，再用Hank's液洗2遍，然后加入RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%FBS)置37℃、5%CO2條件下不換液、不傳代培養(yǎng)。

1.2.3 死亡細胞誘導的分化細胞的形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡觀察:收集腹腔接種H22的小鼠腹水細胞，37℃、5%CO2條件下不換液、不傳代體外培養(yǎng)。當培養(yǎng)細胞幾乎全部死亡時，此時少量換液，于細胞培養(yǎng)的第1天開始倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

電子顯微鏡檢查:收集培養(yǎng)細胞于Eppendorf管中，離心(3000 rpm×15 min)后，輕輕吸棄上清，使其呈細胞團。向Eppendorf管中緩緩滴加戊二醛，使細胞由上而下逐漸固定，然后制備超薄切片，掃描、透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.4 死亡細胞誘導的分化細胞的免疫學標志檢查

收集培養(yǎng)細胞于 Eppendorf管中，離心(1000 rpm×5 min)后棄上清，PBS洗細胞，用毛滴管在載玻片上涂片。10%甲醛室溫固定10 min。PBS沖洗。封閉液(正常兔血清)37℃水浴中孵育20 min后傾去。一抗(羊抗小鼠CD68單克隆抗體，1∶100稀釋)水浴中孵育60 min。PBS沖洗，5 min/遍，共3遍。二抗(FITC標記兔抗山羊IgG，1∶100稀釋)水浴中孵育45 min。PBS沖洗，5 min/遍，共3遍。封片劑(中性樹膠)封片。熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 不同誘導方法培養(yǎng)的巨噬細胞的體外吞噬功能比較

實驗前兩周，向小鼠腹腔內(nèi)注入體積分數(shù)為5%的雞紅細胞懸液1 mL免疫小鼠。實驗當天分離小鼠血清與雞紅細胞在37℃、5%CO2條件下孵育30 min，再與3組細胞繼續(xù)孵育30 min。然后將細胞滴加于潔凈載玻片上，每片加0.5 mL，晾干，即成涂片，瑞氏染色后于光學顯微鏡下觀察。每張涂片取3個不同視野，每個視野計數(shù)100個巨噬細胞，取其平均值。按以下公式計算吞噬百分率及吞噬指數(shù)。

吞噬百分率(%)=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)×100%/巨噬細胞總數(shù)

吞噬指數(shù) =被吞噬的雞紅細胞數(shù) /巨噬細胞總數(shù)

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)為計數(shù)資料，采用χ2檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 死亡細胞誘導的分化細胞的鑒定

2.1.1 形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡觀察:死亡細胞誘導的分化細胞體外培養(yǎng)的第1天，主要為小鼠肝癌腹水瘤細胞(H22)和小鼠腹腔其它細胞，細胞完整(圖1);第6天，大量細胞死亡破裂，有少量細胞的胞漿內(nèi)顆粒消失、折光性變強(圖2);第15天，細胞迅速增大，進入分裂增殖狀態(tài)，體積比一般細胞大十幾倍(圖3);第30天，細胞分裂增殖活躍，獲得高純度、高活性的巨噬細胞(圖4)。

掃描電子顯微鏡檢查:細胞體積較大，形狀不規(guī)則，表面粗糙，有許多密集的微絨毛、微皺褶及囊泡，還有少數(shù)球形隆起，并且可見樹突狀偽足(圖5)。

透射電子顯微鏡檢查:胞漿內(nèi)有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及大量的溶酶體，在積極吞噬的巨噬細胞胞漿內(nèi)有巨大空泡樣結(jié)構(gòu)及大小不一、形態(tài)不規(guī)則的吞噬體(圖6)。

2.1.2 免疫學標志檢查

CD68是巨噬細胞特異性的標志物，可用其抗體進行免疫熒光染色鑒定。熒光顯微鏡觀察可見CD68抗體鑒定的死亡細胞誘導組(D組)巨噬細胞大，熒光強(圖7);PBS誘導組(P組)巨噬細胞小，熒光弱，為陽性對照(圖8)。

2.2 不同誘導方法培養(yǎng)的巨噬細胞的體外吞噬功能比較

D組吞噬率及吞噬指數(shù)與P組和G組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)，死亡細胞誘導的巨噬細胞具有良好的吞噬能力(表1)。

表1 不同誘導方法培養(yǎng)的巨噬細胞體外吞噬能力比較Tab 1 Comparation of phagocytic ability of different macrophages

3 討 論

巨噬細胞是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫的重要對象，滲透到多個學科。盡管國內(nèi)外已有不少文獻報道能從多種組織和器官中分離、純化巨噬細胞［3］，但這些方法十分繁瑣、復雜。本實驗于小鼠腹腔接種肝癌腹水瘤細胞的第7天，在無菌條件下收集腹水細胞進行培養(yǎng)，收集的小鼠腹水細胞成分極為復雜，除了占主要成分的肝癌腹水瘤細胞外，還可能包含其他細胞成分，如小鼠單核細胞、內(nèi)皮細胞等。在死亡細胞誘導的巨噬細胞體外培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)細胞的初始濃度、換液起始時間以及首次換液量都是影響誘導巨噬細胞出現(xiàn)的關(guān)鍵因素。通過對實驗條件的反復摸索，最終將腹水細胞的初始濃度調(diào)為2×106/mL，2 mL/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2條件下不換液、不傳代體外培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的第6天，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分已被旺盛的細胞代謝所耗盡，全部肝癌腹水瘤細胞死亡破裂并釋放內(nèi)容物，然而此時倒置顯微鏡下可觀察到少量細胞的胞漿內(nèi)顆粒消失、折光性變強，表現(xiàn)出活化特征，這種現(xiàn)象很可能是由于細胞培養(yǎng)上清液中含有高濃度的、死亡細胞釋放的、具有佐劑活性的物質(zhì)誘導細胞分化，因此首次換液量不宜過大，否則將會稀釋細胞培養(yǎng)上清液中那些發(fā)揮免疫佐劑作用的物質(zhì)的濃度。通過形態(tài)學觀察、免疫學標志檢查及體外吞噬功能檢測，鑒定死亡細胞誘導的分化細胞為巨噬細胞。本實驗首次應用巨噬細胞體外誘導培養(yǎng)方法，此方法的優(yōu)點就是不需要分離前體細胞和加入外源性細胞因子，操作簡便、經(jīng)濟實用，易于獲得足量的巨噬細胞，可廣泛應用于臨床及實驗研究。

CD68是一種溶酶體相關(guān)膜蛋白，具有參與細胞攝取和溶酶體運輸?shù)淖饔?。CD68主要在巨噬細胞的胞漿內(nèi)表達，細胞膜上的表達較弱［4］，可作為巨噬細胞特異的分化抗原［5］。CD68抗體可以檢測人體許多組織中的巨噬細胞，包括肺泡、脾臟、腸固有層和骨髓中的巨噬細胞，同時也可以標記骨髓前體細胞和外周血粒細胞，可用于骨髓白血病的鑒別和巨噬細胞方面的研究。巨噬細胞標志物CD68的檢測與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸也有著密切聯(lián)系。劉聰?shù)龋?］采用鏈親和素-生物素免疫組織化學法進行CD68的檢測，研究肝細胞性肝癌中枯否細胞的分布及意義。本實驗采用CD68抗體進行免疫熒光染色鑒定，熒光顯微鏡觀察可見CD68抗體鑒定的死亡細胞誘導的巨噬細胞呈綠染色、強陽性。

高立芬等［7］報道刀豆蛋白 A(Concanavalin A，Con A)活化巨噬細胞后，可觀察到巨噬細胞體積增大，表面出現(xiàn)泡狀、樹突狀偽足，胞漿內(nèi)出現(xiàn)豐富的細胞器，線粒體、溶酶體增多。本項研究死亡細胞誘導的巨噬細胞體積較大，形狀不規(guī)則，表面粗糙，有許多密集的微絨毛、微皺褶及囊泡，還有少數(shù)球形隆起，并且可見樹突狀偽足，胞漿內(nèi)有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及大量的溶酶體，在積極吞噬的巨噬細胞的胞漿內(nèi)有巨大空泡樣結(jié)構(gòu)及大小不一、形態(tài)不規(guī)則的吞噬體，細胞膜附近有較多的微絲和微管。結(jié)果表明死亡細胞誘導的巨噬細胞具備巨噬細胞的形態(tài)特征和超微結(jié)構(gòu)特征。

巨噬細胞是體內(nèi)特定的吞噬細胞，巨噬細胞的吞噬功能可作為衡量機體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)的一個重要指標。巨噬細胞能吞噬和殺滅細胞內(nèi)寄生蟲、細菌、自身衰老和死亡的細胞以及腫瘤細胞，參與機體的免疫防御、免疫自穩(wěn)及免疫監(jiān)視功能。靜止的巨噬細胞體積小，活性低，吞噬功能弱。當巨噬細胞被激活后，細胞體積變大、表面突起增多，細胞內(nèi)有完整的細胞器，且溶酶體、線粒體增多，細胞吞噬功能增強。本實驗檢測巨噬細胞體外吞噬功能主要采用改良的吞噬雞紅細胞方法［8］，即實驗前兩周，向小鼠腹腔內(nèi)注入體積分數(shù)為5%的雞紅細胞懸液1 mL免疫小鼠，以刺激小鼠產(chǎn)生抗雞紅細胞抗體。實驗當天分離小鼠血清(含小鼠抗雞紅細胞IgG抗體)與雞紅細胞、巨噬細胞共同孵育，此時IgG抗體作為調(diào)理素促進巨噬細胞的吞噬作用。然后涂片，瑞氏染色后于鏡下觀察，計算吞噬百分率及吞噬指數(shù)，與不同誘導方法培養(yǎng)的巨噬細胞的吞噬能力作以比較，差異均有顯著性意義(P＜0.05)，表明死亡細胞誘導的巨噬細胞具有良好的吞噬能力。

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A novel high-yield macrophage culture in vitro

ZHANG Chun - lei1，HUA Zheng - yu2，YUAN Xiao - lin1，YANG Zhen1，ZHANG Qing1，LI Xiao - huan1
(1.Department of Clinical Laboratory，Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian116001，China;2.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objective］To explore a method of macrophage induced cultivation in vitro without precursor cell and exogenous cytokine.［Methods］Mouse ascites cells were collected from peritoneal cavity and cultivated without replacing culture medium and passing era in vitro at the condition of 37℃ and 5%CO2.When the whole cultivated cells nearly died，a few cells showed that granules in plasma disappeared and refraction became strong.These cells were rapidly augmented and turned into proliferation immediately after replacing little culture medium.By morphological observation，immunological symbol examination and phagocytic function detection in vitro，these cells were identified as macrophages.［Results］Macrophages with high activity were purified according to morphologic characteristics and immunological symbol of specific differentiation antigen of macrophage- CD68.Macrophages induced by death cells had notable discrepancy compared to macrophages that were cultivated by other methods(P＜0.05).It showed that macrophages induced by death cells had well phagocytic ability.［Conclusion］This is the first time to use method of macrophage induced cultivation in vitro without precursor cell and exogenous cytokine.It is a simple，economic and practical method for obtaining sample macrophages applied in clinical and experimental research broadly.

Key words:death cell;induce;macrophage;differentiation

R392

A

1671-7295(2011)05-0512-05

2011-06-16;

2011-08-08

張春蕾(1982-)，女，黑龍江哈爾濱人，助理研究員，碩士。E-mail:zhangchunlei.1982@163.com

袁小林，主任醫(yī)師，博士。E-mail:daiwoguo@sina.com