李晶潔，于彥偉，王召軍，馮薇，周亞濱

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

20年來大量的臨床實踐證明，心肌梗死(MI)后自主神經(jīng)功能嚴(yán)重失調(diào)，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)。有研究表明，MI后交感神經(jīng)激活的機制與心臟局部感受器的反射控制相關(guān)，可能是MI導(dǎo)致來自心臟局部感受器的反射受損，使交感傳出活性受到抑制，但目前對MI后心臟局部交感神經(jīng)損傷及再生機制的研究很少。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)定量研究MI后心臟局部交感神經(jīng)分布情況，觀察中藥養(yǎng)心顆粒對心臟局部交感神經(jīng)損傷及再生過程的影響，以探討其改善MI后自主神經(jīng)功能失調(diào)的機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備及分組

成年健康雜種犬21只，雌雄不拘，體質(zhì)量14～22kg，隨機分為假手術(shù)對照組、MI組與MI+養(yǎng)心顆粒組(MI后每天給予養(yǎng)心顆粒2.53g/kg)各7只。3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈麻醉，氣管插管接人工呼吸機。在無菌條件下，沿左側(cè)第4肋間開胸，在冠狀動脈前降支分出第1對角支的近端，用0號線結(jié)扎冠狀動脈前降支造成左心室前側(cè)壁心肌梗死。假手術(shù)組開胸不結(jié)扎冠脈。術(shù)后三組動物均正常飲食喂養(yǎng)4周。

1.2 養(yǎng)心顆粒藥物制備 將黃芪50g，人參15g，茯神15g，茯苓 15g，半夏 15g，當(dāng)歸 15g，川芎15g 等 13 味中藥，加10倍量水浸泡2h，煎煮2h，過濾后加8倍量水，煎煮1.5h，過濾后加6倍量水煎煮1h，過濾。將3次濾液合并，減壓濃縮至相對密度1.3(60℃)，每克浸膏含生藥 2.86g。按 2.53g/kg喂食，每日 1次，連續(xù)2周。

2 免疫組化測定交感神經(jīng)重構(gòu)情況

2.1 標(biāo)本的取材及固定

活體快速取下心臟，以房室溝為界剪去心房及心底部其它組織，在左心室梗死區(qū)旁距梗死邊緣約0.5cm的非梗死區(qū)取材，取材按左室長軸方向，取材后立即投入4%多聚甲醛固定液中，固定24～48h。石蠟包埋、切片，片厚4～5μm。每例測兩張切片。

2.2 交感神經(jīng)支配密度的測定方法

心肌中交感神經(jīng)支配區(qū)域為洛氨酸羥化酶(TH)陽性染色區(qū)域，TH染色陽性神經(jīng)纖維由Motic Images Advanced 3.2軟件及專用顯微鏡組成的計算機圖像處理系統(tǒng)進行檢測。每張玻片在40×物鏡下進行檢測。依據(jù)陽性免疫反應(yīng)的圖像選擇合適的分割閾值，實現(xiàn)單點生長分割。以人機交互方式測定梗死區(qū)旁非梗死區(qū)的神經(jīng)纖維密度。神經(jīng)密度通過TH陽性纖維在選區(qū)中所占的面積表示(um2/mm2)，其中陽性纖維的面積以um2表示，選取面積以mm2表示。每張玻片中，6個包含最多神經(jīng)結(jié)構(gòu)視野的神經(jīng)密度的平均值代表該玻片的神經(jīng)密度。

2.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)檢驗

所有數(shù)據(jù)輸入計算機，應(yīng)用SPSS 11.5軟件分析。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間的差異比較應(yīng)用t檢驗，兩樣本率的比較采用χ2檢驗。其中P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

3 結(jié)果

假手術(shù)對照組中，心肌細胞之間均可見TH免疫染色陽性的神經(jīng)纖維分布，神經(jīng)纖維主要分布在心內(nèi)膜下、心外膜下及血管旁，其走行與心肌細胞方向一致。

心肌梗死組中，在兩只犬檢測到酪氨酸羥化酶免疫染色神經(jīng)纖維密度明顯增高區(qū)，顯示該局部神經(jīng)增生活躍。該組其它各犬檢測到的神經(jīng)密度亦明顯高于對照組，且神經(jīng)走行紊亂。

心肌梗死+養(yǎng)心顆粒組中，神經(jīng)密度雖高于對照組，但較心肌梗死組密度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且在該組中未檢測到神經(jīng)纖維密度異常增高區(qū)。見表1。

表1 各組犬梗死灶周邊區(qū)交感神經(jīng)支配密度(um2/mm2，±s)

表1 各組犬梗死灶周邊區(qū)交感神經(jīng)支配密度(um2/mm2，±s)

注:相同部位與對照組比較，*P＜0.01;相同部位與心肌梗死組比較，#P ＜0.01。

組別 絡(luò)氨酸羥化酶正常對照組2 917.71 ±190.99心肌梗死組 3 779.86 ±286.57*心肌梗死 +養(yǎng)心顆粒組 3 134.48 ±265.27#

4 討論

近年自主神經(jīng)逐漸被認(rèn)識到是心律失常發(fā)生和持續(xù)的一個重要因素，心律失常與自主神經(jīng)功能紊亂有著必然的聯(lián)系，主要證據(jù)有:大多數(shù)心源性猝死存在晝夜差異，其發(fā)病高峰時間恰與交感神經(jīng)興奮性增高的時間相吻合，且精神因素是強烈的誘發(fā)條件。大規(guī)模臨床實驗證明，β受體阻滯劑可大大減少心肌梗死患者的猝死率［1］，這為自主神經(jīng)維持心肌電活動穩(wěn)定性所起的重要作用提供了有力佐證。但過去對這方面的認(rèn)識多集中在交感神經(jīng)興奮增加心肌組織的易損性上，近年發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心臟局部自主神經(jīng)發(fā)生復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能改變，很可能通過影響心臟電生理穩(wěn)定性參與功能性折返和室性心律失常。

有研究發(fā)現(xiàn)，交感神經(jīng)對缺血的耐受性很差。在不伴有心肌梗死的冠心病病人中，自主神經(jīng)已存在分布異?，F(xiàn)象［2］。動物實驗中，由冠脈狹窄造成的心肌頓抑可引起自主神經(jīng)的分布明顯減少［3］，這說明神經(jīng)比心肌細胞對缺血的耐受性更差，如果缺血持續(xù)40min以上，心肌的神經(jīng)就會發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。MI后1～6周(尤其3～4周)，梗死區(qū)周邊去甲腎上腺素含量先是減少后有所恢復(fù)［4］，這說明MI后心臟局部交感神經(jīng)有動態(tài)變化。酪氨酸羥化酶(TH)是兒茶酚胺生物合成的限速酶，交感神經(jīng)的末梢軸索中含有大量的TH，它的存在標(biāo)志著交感神經(jīng)結(jié)構(gòu)及功能的完整。本研究通過應(yīng)用抗TH的免疫組織化學(xué)方法，檢測心臟中交感神經(jīng)分布，證明MI組與正常對照組相比存在顯著的交感神經(jīng)分布不均現(xiàn)象，特別在2只犬梗死區(qū)周邊的非梗死區(qū)檢測到交感神經(jīng)密度顯著增高區(qū)，呈叢狀分布，神經(jīng)排列不規(guī)則，這說明該部位有交感神經(jīng)再生現(xiàn)象。有研究表明，在體外交感神經(jīng)培養(yǎng)時，慢性神經(jīng)刺激能夠?qū)е耇H表達增強、兒茶酚胺產(chǎn)生增加［5－6］。我們通過在體研究證明，心肌梗死后心肌中存在交感神經(jīng)再生現(xiàn)象。養(yǎng)心顆粒是以益氣養(yǎng)心安神為原則組成的中藥復(fù)方制劑［7］，在多年的臨床工作中，應(yīng)用養(yǎng)心湯作為主方進行加減治療不穩(wěn)定型心絞痛，取得了較好的療效，同時還降低心律失常的發(fā)生機率。本研究應(yīng)用養(yǎng)心顆粒干預(yù)心肌梗死犬，發(fā)現(xiàn)其有抑制心肌梗死后心臟局部交感神經(jīng)過度再生機制，從而為其降低心律失常發(fā)生率提供理論依據(jù)。

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