王建明，王宇，薛紅梅，高珊珊

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥黃連結(jié)腸定位包衣片是以黃連提取物為原料藥，Eudragit(優(yōu)特奇)水分散體為包衣材料，根據(jù)pH敏感－時(shí)間控釋雙重機(jī)理，利用多層包衣技術(shù)制備的新型中藥結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)［1－3］。其理想的體內(nèi)代謝效果是在降低血藥濃度的同時(shí)，提高結(jié)腸局部藥物濃度，從而達(dá)到對(duì)結(jié)腸疾病產(chǎn)生較好的局部治療作用和提高生物利用度的效果［4］。本實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)對(duì)比黃連結(jié)腸定位包衣片和黃連提取物未包衣片芯在生物體內(nèi)的釋藥特征，從而對(duì)黃連結(jié)腸定位包衣片的結(jié)腸定位效率作出評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥

黃連結(jié)腸定位包衣片(自制，規(guī)格:280mg/片，代號(hào)為T(mén));未包衣黃連載藥片芯(自制，規(guī)格:280mg/片，代號(hào)為R);鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)713－8702);磷酸二氫鉀為分析純(天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠);乙腈為色譜純(Dikmapure公司);其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters2487型高效液相色譜儀;KDC－160HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);XW－80A漩渦混合器(江蘇海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司);KQ－300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AG－135型電子分析天平(瑞士 METTLER－TOLEPO公司);微量取樣器(上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.3 受試動(dòng)物

新西蘭健康大耳白兔6只，雌雄各半，體質(zhì)量1.5～2.5kg，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) GLP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件

WinNonlin 5.2版藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 給藥及樣品采集

將6只家兔隨機(jī)等分成兩組，每組3只。受試制劑組(T)，參比制劑組(R)。兩種制劑的給藥劑量均為3片/只，按每日單劑量給藥。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，灌胃時(shí)應(yīng)防止家兔將包衣片嚼碎。

受試家兔給藥前禁食12h，自由飲水。給藥前先自耳緣靜脈采取空白血液，以作空白和回收試驗(yàn)用。按照給藥方案設(shè)計(jì)的給藥方法，分別單次口服受試制劑3片或參比制劑3片。兩組家兔均在給藥后1，2，3，4，5，5.5，6，6.5，7，8，10，12，14，16，18，20，22，24h 于耳緣靜脈取血約2mL置于肝素鈉處理過(guò)的負(fù)壓玻璃管中，膠塞密封，3 000r/min離心15min，分離血漿，移取上清液于離心管中，標(biāo)注試驗(yàn)號(hào)及采血時(shí)間，血樣放置于冰箱冷凍室中－20℃保存，以備處理分析。

2.2 鹽酸小檗堿在生物樣品中的測(cè)定方法與評(píng)價(jià)

2.2.1 血漿樣品預(yù)處理方法的比較

血漿樣品進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究前均需沉淀除去蛋白，本試驗(yàn)分別對(duì)常用蛋白沉淀劑高氯酸、甲醇和乙腈的沉淀效果進(jìn)行了考察。

精密吸取濃度為18μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液50μL于離心管中，水浴40℃揮干溶劑，加入家兔空白血漿100μL，再加入500μL的甲醇，渦旋振蕩混合1min，以3 000r/min離心15min，取上清液，N2吹干，甲醇定容至0.5ml，經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣20μL，重復(fù)2次，利用當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物濃度。同法分別用高氯酸和乙腈處理血漿樣品。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血漿樣品的預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用高氯酸和乙腈沉淀處理蛋白時(shí)，鹽酸小檗堿的檢測(cè)被雜質(zhì)峰所干擾，樣品的峰形不好，回收率過(guò)低。而用甲醇沉淀處理蛋白時(shí)，樣品的峰形很好，回收率也符合藥物動(dòng)力學(xué)的研究要求，因此用甲醇作為蛋白沉淀劑處理血漿樣品更適合本實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 血漿中藥物含量測(cè)定方法的建立

2.2.2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil(TM)C18柱(4.6mm×200mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈 －磷酸二氫鉀(30∶70);檢測(cè)波長(zhǎng):265nm;流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20μL。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品18mg置于100ml的容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到0.18mg/ml的對(duì)照品貯備液，精密移取鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液1mL，以甲醇定量稀釋配制成1.8μg/ml的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，置于4℃冰箱中避光冷藏備用。

2.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取1.8μg/ml的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液40μL，160μL，320μL，400μL，800μL，置于離心管中，于40℃水浴揮干溶劑后，分別精密加入空白血漿1 000μL，渦旋振蕩混合1min后，按血漿樣品預(yù)處理方法進(jìn)行處理。利用高效液相分析測(cè)定，進(jìn)樣量為10μL。以血藥濃度為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為:Y=20 624X+158.67，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 8。

結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在0.072～1.44μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2.4 專屬性考察

將空白血漿、樣品血漿、對(duì)照品溶液和空白血漿加對(duì)照品均按血漿樣品預(yù)處理方法進(jìn)行處理，在上述色譜條件下進(jìn)樣各20μL測(cè)定，所得色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 血漿樣品的專屬性

由圖可見(jiàn)，在上述色譜條件下，鹽酸小檗堿的保留時(shí)間均為11min左右，且分離度良好，血漿內(nèi)源物質(zhì)不干擾鹽酸小檗堿的測(cè)定，因此本方法具有良好的專屬性。

2.2.2.5 靈敏度試驗(yàn)

配 制 濃 度 為 0.007 2，0.072，0.288，0.432，1.44μg/ml血漿對(duì)照品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法處理進(jìn)樣，重復(fù)3次，測(cè)得各質(zhì)量濃度鹽酸小檗堿的峰面積與噪音峰面積，按色譜峰信噪比S/N≥3時(shí)鹽酸小檗堿的質(zhì)量濃度為最低檢測(cè)質(zhì)量濃度，結(jié)果得出鹽酸小檗堿最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.007 2μg/ml。

2.2.2.6 回收率試驗(yàn)

方法回收率:取空白血漿100μL，加入鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，配制高、中、低三種不同濃度的鹽酸小檗堿血漿樣品(濃度分別為 72、36、7.2μg/mL)，按照血漿樣品的處理方法和測(cè)定方法操作，進(jìn)樣分析，由當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品的濃度，并與加入濃度相比較，計(jì)算平均方法回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

絕對(duì)回收率:按照方法回收率實(shí)驗(yàn)方法配制高、中、低3種濃度的鹽酸小檗堿血漿樣品(濃度分別為72、36、7.2μg/mL)，血漿樣品經(jīng)預(yù)處理后，進(jìn)樣分析，將結(jié)果與同等濃度的標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣分析測(cè)得的峰面積相比較，計(jì)算平均絕對(duì)回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2.7 精密度試驗(yàn)

取空白血漿100μL，加入鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，配制成高、中、低三種不同濃度的鹽酸小檗堿血漿樣品(濃度分別為 72、36、7.2μg/mL)，按照血漿樣品的處理方法和測(cè)定方法，進(jìn)樣分析同一樣品溶液平行操作5次，同一批樣品溶液連續(xù)測(cè)定5天，由當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品的濃度，求得日內(nèi)及日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率與精密度測(cè)定結(jié)果 (n=5)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該研究方法在高、中、低三個(gè)濃度水平的方法平均回收率大于80%;絕對(duì)平均回收率大于90%;血漿樣品的日內(nèi)、日間的精密度RSD皆小于5%，滿足生物樣品的測(cè)定要求，能夠用于受試制劑和參比制劑的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究。

2.2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

血漿樣品按血漿樣品預(yù)處理方法和測(cè)定方法，在48h之內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣分析，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD值為3.68%，表明血漿樣品至少在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 家兔體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

將6只家兔隨機(jī)分為兩組，分別采用黃連提取物結(jié)腸定位包衣片和未包衣片芯口服給藥后，在不同時(shí)間點(diǎn)采血，按血漿樣品預(yù)處理的方法和樣品測(cè)定方法，通過(guò)反相高效液相色譜RP－HPLC方法測(cè)定鹽酸小檗堿的血藥濃度。得到平均血藥濃度－時(shí)間曲線見(jiàn)圖2及圖3;所得數(shù)據(jù)用藥動(dòng)學(xué)軟件WinNonlin 5.2進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，結(jié)果表明，黃連結(jié)腸定位包衣片和未包衣片口服后在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)均符合一室模型，主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

圖2 家兔口服黃連未包衣片后的血藥濃度－時(shí)間曲線

圖3 家兔口服黃連包衣片后的血藥濃度時(shí)間曲線

表3 參比制劑與受試制劑主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的比較

3 討論

鹽酸小檗堿為中國(guó)藥典收載的常用抗菌藥，在治療腸炎方面療效顯著，副作用小。但如果作為治療結(jié)腸疾病的藥物，到達(dá)病灶處的藥量過(guò)低嚴(yán)重影響了鹽酸小檗堿的生物利用率［5］。而黃連的結(jié)腸定向包衣片擁有直接作用結(jié)腸，避免胃酸、酶類破壞，降低血藥濃度，延長(zhǎng)作用時(shí)間，減少毒副作用等特點(diǎn)［6－8］。因此為解決其生物利用度低的問(wèn)題提供一個(gè)良好的方案。

本試驗(yàn)血漿樣品成分比較復(fù)雜，干擾物多，待測(cè)藥在血漿中的含量很低，不經(jīng)預(yù)處理往往不易被儀器檢出。因此對(duì)不同方法處理的樣品進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明，本試驗(yàn)中采用甲醇作為蛋白沉淀劑比高氯酸和乙腈的沉淀效果更好。

本研究顯示，黃連結(jié)腸定位包衣片與未包衣片在家兔體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)行為差異顯著，未包衣片芯口服后0.5h即可檢測(cè)到藥物，Tmax為3h，而結(jié)腸定位包衣片在口服5h后才可檢測(cè)出藥物，Tmax為8h，這與體外時(shí)滯相比略有延遲。表明受試制劑在胃內(nèi)和小腸部的釋放量少，降低了胃部胃酸的降解和小腸吸收的肝首過(guò)效應(yīng)，提高了生物利用率。結(jié)腸定位包衣片的AUC值僅為普通片的30.1%，其Cmax值僅為普通片的22.1%，這說(shuō)明吸收進(jìn)入血液循環(huán)的藥量顯著降低，從而使大部分藥物停留在結(jié)腸局部，有利于結(jié)腸局部病變部位的治療。

本實(shí)驗(yàn)表明，黃連結(jié)腸定向包衣片可以將藥物輸送到結(jié)腸部位達(dá)到結(jié)腸定位靶向效果，且效果明顯，可以顯著提高了藥物的生物利用率。

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