李冀，李勝志，柴劍波，畢珺輝，胡曉陽(yáng)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

中醫(yī)證候動(dòng)物模型的研究，一直是中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的焦點(diǎn)，也是難點(diǎn)，目前實(shí)驗(yàn)性消化性潰瘍的動(dòng)物模型造模方法比較豐富，但不能充分體現(xiàn)中醫(yī)辨治的特點(diǎn)，使得現(xiàn)代疾病與中醫(yī)證的緊密關(guān)系不能很好得到體現(xiàn)，本研究在“病證結(jié)合”理論基礎(chǔ)上，將消化性潰瘍病與中醫(yī)寒、熱證相結(jié)合，建立實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍寒、熱證型動(dòng)物模型，實(shí)加經(jīng)典寒、熱方劑干預(yù)，通過(guò)對(duì)血清皮質(zhì)醇含量的測(cè)定，揭示胃潰瘍寒、熱證證候?qū)嵸|(zhì)及方證相應(yīng)規(guī)律。

1 實(shí)驗(yàn)材料及藥物制備

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心(GLP)，合格證號(hào)SCXK(京)2007－0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 熱因素:將辣椒粉過(guò)120目篩，溶入60%無(wú)水乙醇中，配制成8%干辣椒粉的乙醇混懸液。寒因素:氫氧化鈉(NaOH)，稱(chēng)取6g NaOH，溶入500ml雙蒸水中，配成0.3mol/L濃度。冰水:冷凍保存，使用時(shí)提前取出溶化。大黃黃連瀉心湯、理中丸:按原方藥量及比例制備，其中，大黃黃連瀉心湯濃縮至每毫升含0.5g生藥量，理中丸濃縮至每毫升含1g生藥量的液體，冰箱存儲(chǔ)備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 鹽酸:上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站。乙醚(分析純級(jí)):上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站。NaOH:天津市博大化工有限公司。甲醛(分析純級(jí)):天津市博大化工有限公司。冰乙酸:上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站生產(chǎn)。COR檢測(cè)試劑盒:美國(guó)RD公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組 各取用Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220g，雌雄各半，給予標(biāo)準(zhǔn)的大鼠食物和水，實(shí)驗(yàn)前大鼠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)習(xí)服7天。幽門(mén)結(jié)扎型取140只大鼠按體重隨機(jī)分為6組:即寒假組(寒因素+假手術(shù))30只、熱假組(熱因素+假手術(shù))30只、寒幽組(寒因素+幽門(mén)結(jié)扎)30只、熱幽組(熱因素+幽門(mén)結(jié)扎)30只、模幽Ⅰ組(幽門(mén)結(jié)扎)10只、空白對(duì)照組10只。水浸應(yīng)激模型取140只大鼠按體重隨機(jī)分為6組:即單寒組(單純寒因素)30、只單熱組(單純熱因素)30只、寒水組(寒因素+水浸應(yīng)激)30只、熱水組(熱因素+水浸應(yīng)激)30只、單水組(水浸應(yīng)激模型)10只、空白對(duì)照組10只。

2.2 造模方法

2.2.1 胃寒、熱模型［1］

2.2.2 束縛水浸應(yīng)激型胃潰瘍模型［3－4］

2.2.3 幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍模型［5］

2.2.4 假手術(shù)方法［4］

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

2.3.1 水浸應(yīng)激型胃潰瘍寒、熱證模型的建立及寒、熱方劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)

將各組動(dòng)物分別按上述胃寒、熱證造模方法，進(jìn)行寒、熱因素灌胃，給予相應(yīng)造模劑;模型組及空白對(duì)照組則給予等體積生理鹽水，連續(xù)7d。寒、熱因素造模后，將受試大鼠(除空白對(duì)照組、模水組)在各自組別內(nèi)按體重隨機(jī)分成3組:即熱水、熱水大、熱水理;寒水、寒水大、寒水理;單熱、單熱大、單熱理;單寒、單寒大、單寒理。按組別，各給藥組按組別分別給予相應(yīng)受試方劑，大黃黃連瀉心湯劑量1.8g/Kg體重，理中丸劑量3.6g/Kg體重;日2次，連續(xù)4d。水應(yīng)激法造模前30min再給藥1次。其它組給予等體積生理鹽水，連續(xù)4d;末次給藥后將受試大鼠禁食不禁水30h(注意勿使動(dòng)物食入糞便和墊料等雜物，以免影響造模結(jié)果)。水浸應(yīng)激型胃潰瘍?cè)炷ｉ_(kāi)始前30分鐘，再給藥1次。

2.3.2 幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍寒、熱證模型的建立及寒、熱方劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)

寒、熱因素造模方法同上。造模后將受試大鼠(除空白對(duì)照組、模幽組)在各自組別內(nèi)按體重隨機(jī)分成3組:熱幽、熱幽大、熱幽理;寒幽組、寒幽大、寒幽理;熱假、熱假大、熱假理;寒假組、寒假大、寒假理。按組別，各給藥組按組別分別給予相應(yīng)受試方劑，方法同上。末次給藥后將受試大鼠禁食不禁水30h，將相應(yīng)組別分別行幽門(mén)結(jié)扎術(shù)及假手術(shù)，并于術(shù)前2h灌胃相應(yīng)藥物1次，術(shù)中由十二指腸分別給予干預(yù)藥物。

2.4 實(shí)驗(yàn)取材 分別于水浸應(yīng)激7h后，幽門(mén)結(jié)扎術(shù)后18h，取血，分離血清待測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)通過(guò)Spss13.0軟件包用單因素方差分析(one－way ANOVA)LSD或S－N－K法進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)，用(±s)表示結(jié)果。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 寒、熱方劑對(duì)水浸應(yīng)激型胃潰瘍寒、熱證模型大鼠血清COR含量的影響

表1 水浸應(yīng)激型胃潰瘍寒、熱證模型間大鼠血清COR的含量變化(±s)

表1 水浸應(yīng)激型胃潰瘍寒、熱證模型間大鼠血清COR的含量變化(±s)

注:與空白組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與熱水組比較△P＜0.05;與單熱組比較☆☆P＜0.01。

組別 n COR(ng/ml)10 31.33 ±10.46單水 10 44.28 ±13.79＊△寒水 8 41.39 ±8.99＊△單寒 10 34.29 ±8.77☆☆熱水 9 60.61 ±16.70＊＊單熱 10 47.93 ±8.68空白＊＊△

由表1可知:除單寒組外各模型組血清COR的含量均明顯高于空白對(duì)照組，具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，以熱水組含量升高顯著。熱水組與單水、單熱組比較有顯著性差異(P＜0.05);熱水與寒水比較升高明顯，有顯著性差異(P＜0.05);單熱與單寒組比較升高明顯，具有顯著性差異(P＜0.01)。

表2 寒、熱方劑對(duì)水浸應(yīng)激型胃潰瘍寒證大鼠血清COR含量的影響(±s)

表2 寒、熱方劑對(duì)水浸應(yīng)激型胃潰瘍寒證大鼠血清COR含量的影響(±s)

組別 n COR(ng/ml)41.39 ±8.99寒水大 7 40.28 ±11.55寒水理 9 33.75 ±8.97單寒 10 34.29 ±8.77單寒大 8 36.08 ±7.94單寒理寒水8 9 37.89 ±10.02

表3 寒、熱方劑對(duì)水浸應(yīng)激型胃潰瘍熱證大鼠血清COR含量的影響(±s)

表3 寒、熱方劑對(duì)水浸應(yīng)激型胃潰瘍熱證大鼠血清COR含量的影響(±s)

注:與單熱組比較，☆P ＜0.05;與熱水組比較，△△P ＜0.01。

組別 n COR(ng/ml)熱水9 51.15 ±16.68 60.61 ±16.70熱水大 8 35.97 ±10.33△△熱水理 8 50.27 ±12.26單熱 10 47.93 ±8.68單熱大 8 36.68 ±12.68☆單熱理8

從表2、3可知，熱水大、單熱大與熱水、單熱組比較血清COR的含量明顯降低，有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。

4.2 寒、熱方劑對(duì)幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍寒、熱證模型大鼠血清COR含量的影響

表4 幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍寒、熱證模型間大鼠血清COR的含量變化(±s)

表4 幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍寒、熱證模型間大鼠血清COR的含量變化(±s)

注:與空白組比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與熱幽組比較△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組別 n COR(ng/ml)10 30.50 ±7.84 10 33.59 ±7.97模幽 10 42.81 ±8.39＊△△寒幽 10 42.93 ±10.25*熱幽 10 57.33 ±10.78＊＊單熱假 10 44.73 ±9.42＊△單寒假空白

由表4可知:除單寒假組外各模型組血清COR的含量均明顯高于空白對(duì)照組，具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，以熱幽組含量升高顯著。熱幽與模幽、熱假組比較血清COR的含量明顯升高，具有顯著性差異(P ＜0.05或P ＜0.01)。

表5 寒、熱方劑對(duì)幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍寒證大鼠血清COR含量的影響(±s)

表5 寒、熱方劑對(duì)幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍寒證大鼠血清COR含量的影響(±s)

組別 n COR(ng/ml)10 42.93 ±10.25寒幽理 10 44.22 ±12.23寒幽大 10 33.60 ±9.62單寒假 10 30.50 ±7.84寒假理 10 32.54 ±9.68寒假大寒幽10 34.84 ±9.05

表6 寒、熱方劑對(duì)幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍熱證大鼠血清COR含量的影響(±s)

表6 寒、熱方劑對(duì)幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍熱證大鼠血清COR含量的影響(±s)

注:與熱幽組比較，△△P＜0.01;與熱假組比較，★P ＜0.05。

組別 n COR(ng/ml)10 57.33 ±10.78熱幽理 10 59.11 ±8.85熱幽大 10 40.61 ±7.76△△單熱假 10 44.73 ±9.42熱假理 10 46.31 ±13.22熱假大 10 34.41 ±11.45熱幽★

從表5、6可知:熱幽大、熱假大與熱幽、熱假模型組比較血清COR的含量明顯降低，具有顯著性差異(P ＜0.05 或 P ＜0.01)。

5 討論

在應(yīng)激反應(yīng)中，腎上腺被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵性的器官。機(jī)體受到刺激時(shí)，都會(huì)引起垂體的ACTH分泌增多，隨之腎上腺皮質(zhì)功能增強(qiáng)，分泌出大量的皮質(zhì)醇，從而提高機(jī)體的抵抗能力，即應(yīng)激反應(yīng)。然而，過(guò)強(qiáng)的刺激又會(huì)出現(xiàn)負(fù)面的并發(fā)癥，最常見(jiàn)的是潰瘍的發(fā)生。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇水平與潰瘍有一定的關(guān)系，應(yīng)激狀態(tài)能產(chǎn)生潰瘍，潰瘍病變的程度與皮質(zhì)醇水平明顯相關(guān)，預(yù)先給予抑制皮質(zhì)醇產(chǎn)生的藥物可防止?jié)兊陌l(fā)生。在應(yīng)激時(shí)血漿皮質(zhì)醇分泌增多是最重要的一個(gè)反應(yīng)，具有重要的生理意義，對(duì)機(jī)體抵抗有害刺激起著極為重要的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所建立的水浸應(yīng)激型、幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍寒、熱證病證結(jié)合動(dòng)物模型具有可行性。束縛水浸及幽門(mén)結(jié)扎皆屬于一種應(yīng)激反應(yīng)，故單純證模型皆見(jiàn)COR含量增加，施加的熱因素對(duì)模型的COR含量體現(xiàn)出明顯的影響，故血清COR的含量在熱性潰瘍模型中升高最為顯著，發(fā)揮了損傷作用，可作為臨床潰瘍熱證的微觀指征。其作用機(jī)制可能為熱證造模后中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)激活垂體－腎上腺軸導(dǎo)致皮質(zhì)激素分泌增加，破壞胃黏膜保護(hù)屏障，從而加速潰瘍的發(fā)生。經(jīng)寒性方劑大黃黃連瀉心湯治療后，各熱性模型血清COR的含量均有明顯降低，但對(duì)寒性模型COR的含量無(wú)影響?？芍?，寒性方劑大黃黃連瀉心湯預(yù)防水浸應(yīng)激型胃潰瘍熱證、幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍熱證的作用機(jī)制可能與抑制皮質(zhì)醇分泌，提高機(jī)體抗應(yīng)激能力有關(guān)。說(shuō)明在潰瘍病的病理狀態(tài)下，寒性方劑通過(guò)“方證相應(yīng)”降低熱證模型大鼠血清COR的含量而達(dá)到預(yù)防潰瘍的目的。

［1］ 李冀，謝田，畢珺輝，等.大黃黃連瀉心湯、理中丸對(duì)幽門(mén)結(jié)扎型、醋酸涂抹型胃潰瘍寒熱證模型大鼠胃組織PGE2含量的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28(2):27 －31.

［2］ 畢珺輝，李冀，謝田，等.大黃黃連瀉心湯、理中丸對(duì)四種模型大鼠血清PAF含量的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(2):51－55.

［3］ 李冀，謝田，柴劍波，等.大黃黃連瀉心湯、理中丸對(duì)幽門(mén)結(jié)扎型、醋酸涂抹型胃潰瘍寒熱證模型大鼠血清NT含量的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(1):38 －41.

［4］ 李冀，謝田，柴劍波，等.大黃黃連瀉心湯、理中丸對(duì)幽門(mén)結(jié)扎型、醋酸涂抹型胃潰瘍寒、熱證模型大鼠血清TXB2含量的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(4):14 －16.

［5］ 李冀，謝田，于海，等.大黃黃連瀉心湯、理中丸對(duì)消炎痛型及水浸應(yīng)激型胃潰瘍寒熱證模型大鼠胃組織EGF、TGF－a含量的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28(5):52 －55.