蔡文輝，王亞賢，楊景云

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154002)

重癥急性胰腺炎(SAP)是一種發(fā)病機理復雜、治療難度大的危急重癥，至今其治療效果在臨床上仍不夠理想。此時，腸道免疫功能和整體免疫功能均處于抑制狀態(tài)，繼而腸道屏障被破壞，導致細菌易位［1］、內(nèi)毒素血癥［2］的發(fā)生，對機體可造成二次打擊，這已成為80%SAP患者的直接死因。所以，提高免疫功能對于SAP的治療是非常重要的。本實驗旨在探討靈芝孢子粉對SAP患者出現(xiàn)的免疫功能低下的調(diào)整作用，以減少其并發(fā)癥，提高治愈率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選擇成年SD大鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量為220g～280g，由佳木斯大學動物中心提供。

1.1.2 藥物與試劑 ?；悄懰徕c(美國Sigma公司);奧曲肽(印度太陽藥業(yè)有限公司);靈芝孢子粉(上海康舟真菌多糖有限公司);淀粉酶(AMS)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);白細胞介素－2(IL－2)放免藥盒(北京福瑞生物工程公司);分泌型IgA(sI-gA)免疫放射試劑測定盒(北京福瑞生物工程公司)。

1.1.3 主要儀器 γ(珈瑪)免疫計數(shù)器(型號:XH－6020，中國核工業(yè)總公司西安二六二廠);多管架自動平衡離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);760CRT雙光束紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);顯微鏡(日本)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 70只大鼠隨機分為五組，每組14只。其中，Ⅰ組為假手術組，Ⅱ組為SAP模型組(簡稱模型組)，Ⅲ組為奧曲肽治療組(簡稱奧曲肽組)，Ⅳ組為靈芝孢子粉治療組(簡稱靈芝組)，Ⅴ組為靈芝孢子粉和奧曲肽聯(lián)合治療組(簡稱奧靈聯(lián)合組)。各組均嚴格按照具體要求制備相應模型［2］。

1.2.2 給藥方法 根據(jù)各組的不同情況進行給藥［2］。

1.2.3 血清淀粉酶(AMS)含量的檢測 各組大鼠于術后6h、12h、24h 分別檢測 AMS 含量［2］。

1.2.4 腸黏膜sIgA含量的檢測 根據(jù)實驗條件，將大鼠斷髓后，切取回腸末端，冷生理鹽水沖洗腸腔，取腸粘膜，稱取0.5g，加生理鹽水 0.5ml，勻漿后4℃冷藏過夜，3 000rpm低溫離心10min，取上清檢測。采用免疫放射法(雙抗體夾心法)，嚴格按照說明書操作步驟進行操作。

1.2.5 血清中IL－2含量的檢測 將大鼠淺麻醉后，從其內(nèi)眥靜脈處取血，3 000rpm離心15min后，取血清檢測。采用放免法按說明書中的測定方法進行操作。

1.2.6 吞噬細胞的吞噬功能檢測 在各組大鼠處死前，由尾靜脈注入印度墨汁(用生理鹽水稀釋5倍)10ml/kg，于注射后2、7min 分別從眼眶取血20μl，加到2ml 0.1%碳酸鈉中搖勻，2h后用紫外分光光度計(λ=680nm)測定其吸光度值，按下列公式計算吞噬率K值:K=(logOD1－logOD2)/(t2－t1)。

1.2.7 胰腺組織病理學檢查 取出動物胰腺組織，用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋切片，HE染色后，用光鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 AMS含量的檢測結(jié)果

2.1.1 模型組與假手術組AMS的定量檢測 正常大鼠循環(huán)血中含有一定量的淀粉酶，SAP時血清淀粉酶含量顯著上升(P＜0.05)，證明重癥急性胰腺炎模型制備成功［2］。

2.1.2 各治療組與模型組AMS的定量檢測 結(jié)果顯示，單用靈芝孢子粉不能及時有效降低血清淀粉酶［2］。

2.2 腸黏膜內(nèi)sIgA含量的檢測結(jié)果

2.2.1 模型組與假手術組的檢測 結(jié)果見表1。

表1 模型組與假手術組腸黏膜內(nèi)sIgA含量的檢測結(jié)果比較(±s)

表1 模型組與假手術組腸黏膜內(nèi)sIgA含量的檢測結(jié)果比較(±s)

注:與假手術組比較，t=6.792，*P ＜0.05。

n sIgA(ng/ml)14 29.02 ±4.45模型組 8 13.26 ±6.45假手術組*

SAP時腸黏膜內(nèi)sIgA的含量明顯降低，與假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明SAP時腸道免疫功能減弱。

2.2.2 各治療組與模型組sIgA含量的檢測 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠腸黏膜內(nèi)sIgA含量的檢測結(jié)果比較(±s)

表2 各組大鼠腸黏膜內(nèi)sIgA含量的檢測結(jié)果比較(±s)

注:與模型組比較，*P＞0.05;△P＜0.05;與奧曲肽組比較，#P＜0.05;與靈芝組比較，○P ＜0.05。

n sIgA(ng/ml)13.26 ±6.45奧曲肽組 9 13.78 ±3.06*靈芝組 10 18.36 ±3.00△#奧靈聯(lián)合 12 23.73 ±3.57△#○模型組8

奧曲肽組僅略增加腸黏膜內(nèi)sIgA的含量，與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明奧曲肽在提高腸道免疫功能方面作用極小。靈芝組與奧靈聯(lián)合組均能在一定程度上增加其含量，與模型組、奧曲肽組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，奧靈聯(lián)合組比靈芝組效果更好(P＜0.05)，說明靈芝孢子粉具有增強腸道免疫功能的作用。

2.3 IL－2含量的檢測結(jié)果

2.3.1 模型組與假手術組IL－2含量的檢測 結(jié)果見表3。

表3 模型組與假手術組IL－2含量的檢測結(jié)果比較(±s)

表3 模型組與假手術組IL－2含量的檢測結(jié)果比較(±s)

注:與假手術組比較，t=9.625，*P ＜0.05。

n IL－2(ng/ml)14 2.35 ±0.30模型組 8 1.24 ±0.16假手術組*

SAP大鼠血清中IL－2的含量與假手術組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明SAP時免疫功能減弱。

2.3.2 各治療組與模型組IL－2含量的檢測 結(jié)果見表4。

表4 治療組與模型組IL－2含量的檢測結(jié)果比較(±s)

表4 治療組與模型組IL－2含量的檢測結(jié)果比較(±s)

注:與模型組相比較，*P＞0.05，△P＜0.05;與奧曲肽組比較，#P＜0.05;與靈芝組比較，○P ＞0.05。

n IL－2含量(ng/ml)1.24 ±0.16奧曲肽組 9 1.31 ±0.18*靈芝組 10 1.60 ±0.15△#奧靈聯(lián)合 12 1.71 ±0.10△#○模型組8

靈芝組、奧靈聯(lián)合組均可提高IL－2的含量，與模型組、奧曲肽組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，驗證了靈芝孢子粉有增強免疫功能的作用。奧靈聯(lián)合組比靈芝組效果更好，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。奧曲肽組略提高其含量，差異不顯著(P＞0.05)，說明奧曲肽在增強免疫功能方面作用甚小。

2.4 吞噬細胞的碳廓清能力的檢測結(jié)果

2.4.1 模型組與假手術組碳廓清能力的檢測 結(jié)果見表5。

表5 模型組與假手術組的吞噬細胞的碳廓清能力的比較(±s)

表5 模型組與假手術組的吞噬細胞的碳廓清能力的比較(±s)

注:與假手術組相比較，t=9.176，*P ＜0.05。

n吞噬率K值14 0.050 5 ±0.005 3模型組 8 0.022 2 ±0.009 3假手術組*

SAP組大鼠的血碳清除率與假手術組比較明顯降低，差異顯著(P＜0.05)，說明SAP時吞噬細胞的吞噬功能明顯減弱。

2.4.2 各治療組與模型組碳廓清能力的檢測 結(jié)果見表6。

表6 治療組與模型組的吞噬細胞的碳廓清能力的比較(±s)

表6 治療組與模型組的吞噬細胞的碳廓清能力的比較(±s)

注:與模型組比較，*P＞0.05，△P＜0.05;與靈芝組比較，#P＞0.05。

n吞噬率K值0.0222 ±0.0093奧曲肽組 9 0.0286 ±0.0075*靈芝組 10 0.0372 ±0.0075△奧靈聯(lián)合 12 0.0413 ±0.0062△#模型組8

經(jīng)靈芝孢子粉治療后，吞噬細胞的功能大大增強，靈芝組、奧靈聯(lián)合組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明靈芝孢子粉具有增強吞噬細胞吞噬功能的作用。奧曲肽組與模型組相比，差異不顯著(P＞0.05)。奧靈聯(lián)合組與靈芝組間，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.5 胰腺組織病理學檢查結(jié)果

SAP模型組胰腺結(jié)構(gòu)不清，點狀或局灶性壞死;炎性細胞大量浸潤，紅細胞滲出極明顯，再一次證明模型制備成功。經(jīng)靈芝孢子粉治療后，病變減輕。

3 討論

膽胰管逆行注射?；悄懰徕c造模法是模擬臨床上膽汁返流性胰腺炎的最常用的模型，因其在病因、致病機制及病變等方面與人類臨床重癥急性胰腺炎相似，且誘發(fā)成功率高，有很好的重復性和可比性。本實驗采用此法，經(jīng)檢測觀察到典型的重癥急性胰腺炎特征。免疫功能受到抑制，機體清除局部和全身細菌的能力下降。本實驗觀察到，SAP模型組吞噬細胞的吞噬功能明顯下降(P＜0.05)，IL－2含量和腸黏膜內(nèi)sIgA的含量均減少，亦證明了此觀點。IL－2主要由活化的TH細胞產(chǎn)生，具有促進T細胞增殖、增強殺傷T細胞、NK細胞的活性等廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，也能促進B細胞增殖分化合成相應抗體，激活單核吞噬細胞使之分泌功能和吞噬能力顯著增強，是維持正常免疫功能和抵御感染的重要因素，位居免疫調(diào)節(jié)的中心地位。sIgA是影響腸道免疫功能的最重要的因素，在創(chuàng)傷、燒傷、失血性休克等應激條件下，黏膜固有層中淋巴細胞和上皮內(nèi)淋巴細胞都明顯減少，IgA+漿細胞呈選擇性抑制，sIgA也隨之減少，導致腸道免疫功能減退，細菌突破腸道屏障的機會就會增加，引起感染。目前，多數(shù)學者認為，SAP患者細胞免疫功能低下是其發(fā)生感染并發(fā)癥及死亡率高的原因［2］。

靈芝孢子粉具有廣泛的藥理作用［3］，本研究應用靈芝孢子粉治療后，實驗動物的免疫功能明顯增強，說明靈芝孢子粉在治療SAP方面有一定的作用。但其不能有效地降低血清淀粉酶含量，所以不宜單用。本研究認為，靈芝孢子粉聯(lián)合西藥治療SAP可能會有更廣闊的前景。

［1］ 蔡文輝，楊景云.靈芝孢子粉對重癥急性胰腺炎大鼠腸道微生態(tài)失調(diào)的調(diào)整作用［J］.中國微生態(tài)學雜志，2008，20(2):140 －142.

［2］ 蔡文輝，張磊，楊景云.靈芝孢子粉在治療重癥急性胰腺炎方面的作用［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2009，33(1):50 －52.

［3］ 林志彬，王鵬云.靈芝孢子及其活性成分的藥理研究［J］.北京大學學報:醫(yī)學版，2006，38(5):541 －547.