吳勃巖，孫陽(yáng)，梁穎，吳勃力，畢克濱，趙文靜，裴麗，王艷杰

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究已經(jīng)成為生命科學(xué)中的研究熱點(diǎn)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為治療腫瘤的重要途徑。齊墩果酸(Olesnolic Acid，簡(jiǎn)稱OA)，為三萜類脂溶性活性物質(zhì)，是一種天然產(chǎn)物化學(xué)成分，廣泛存在于女貞子、白花蛇舌草、夏枯草、大棗、牛膝、西洋參、連翹、山芝麻、甘草等植物中。齊墩果酸具有多種藥理作用，具有保肝降酶、抗炎、抗病毒、免疫雙向調(diào)解作用、抑瘤、抗衰老等作用［1］。本文研究齊墩果酸對(duì)肉瘤S－180荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53基因、Bcl－2基因表達(dá)的影響，探討抗腫瘤作用機(jī)制，為齊墩果酸用于腫瘤治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物、瘤株和試劑

齊墩果酸(珠海潤(rùn)都制藥有限公司);小鼠S－180腹水瘤株(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院);PV二步法檢測(cè)試劑盒及p53、Bcl－2單抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);環(huán)磷酰胺(CTX，上海華聯(lián)制藥有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 昆明種小鼠S－180肉瘤腫瘤模型的建立

抽取小鼠S－180腹水用生理鹽水1∶2稀釋，取昆明種小鼠30只，以0.1ml/只接種右側(cè)腋下制備局灶性實(shí)體瘤模型。

2.2 凋亡調(diào)控基因p53、Bcl－2表達(dá)的檢測(cè)

取接種S－180腫瘤細(xì)胞的小鼠隨機(jī)分為3組:模型組，CTX組，OA組。于接種S－180腫瘤細(xì)胞6h后首次給藥，OA組每天按2.496mg/kg體重灌服給藥1次，CTX組按40mg/kg體重腹腔注射1次，模型組每天用生理鹽水0.2ml/只灌服1次，連續(xù)給藥8天。處死小鼠剝離腫瘤組織，采用PV二步法免疫組化法常規(guī)制片，檢測(cè)凋亡調(diào)控基因p53、Bcl－2表達(dá)的情況。利用Motic Images Advanced 3.2分析軟件對(duì)各組腫瘤組織中凋亡調(diào)控基因表達(dá)產(chǎn)物突變型p53蛋白陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值和Bcl－2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值進(jìn)行分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 齊墩果酸對(duì)S－180荷瘤小鼠腫瘤組織中突變型p53蛋白和Bcl－2蛋白表達(dá)的影響(±s)

表1 齊墩果酸對(duì)S－180荷瘤小鼠腫瘤組織中突變型p53蛋白和Bcl－2蛋白表達(dá)的影響(±s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05。

組別給藥量(mg/kg)n 平均光密度值(±s)p53蛋白 Bcl－2蛋白模型組 － 10 0.261 4 ±0.016 7 0.248 8 ±0.009 5 CTX 組 40 10 0.214 0 ±0.010 6* 0.203 4 ±0.005 6*OA 組 2.496 10 0.241 2 ±0.018 5* 0.232 2 ±0.011 6*

3 結(jié)果

齊墩果酸對(duì)S－180荷瘤小鼠腫瘤組織中凋亡調(diào)控基因p53、Bcl－2表達(dá)的影響，經(jīng)免疫組化方法染色后，觀察p53蛋白和Bcl－2蛋白表達(dá)在細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒狀染色為陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞核藍(lán)染的細(xì)胞為蘇木素復(fù)染的陰性細(xì)胞。在10×40高倍鏡下，每張標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，精確選取視野內(nèi)所有的陽(yáng)性顆粒，對(duì)S－180荷瘤小鼠腫瘤組織中各組突變型p53蛋白和Bcl－2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值進(jìn)行分析。結(jié)果見(jiàn)表1，與模型組比較，齊墩果酸組突變型p53蛋白和Bcl－2蛋白平均光密度值均明顯降低(P＜0.05)，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤的分子機(jī)制之一，許多人類惡性腫瘤的發(fā)展是其細(xì)胞的死亡過(guò)程嚴(yán)重受阻，而使腫瘤細(xì)胞在數(shù)量上無(wú)限制惡性增殖的結(jié)果。p53基因是與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，p53基因抗腫瘤的機(jī)制之一就是觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。p53基因分野生型和突變型兩種類型。野生型p53基因通過(guò)下調(diào)Bcl－2蛋白，上調(diào)Bax蛋白而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;p53基因與其它調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基因或因子也相互作用和相互影響。而突變型p53基因則對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用，p53基因突變后變?yōu)榘┗?，并且表達(dá)增強(qiáng)，突變型p53蛋白半衰期延長(zhǎng)，在組織和細(xì)胞中能檢測(cè)到升高，故一般認(rèn)為免疫組化檢測(cè)到的是突變的p53基因表達(dá)產(chǎn)物，突變型p53基因具有致癌作用，其表達(dá)產(chǎn)物在人類大多數(shù)腫瘤中都過(guò)量表達(dá)。突變型p53蛋白表達(dá)增高與DNA修復(fù)能力的下降呈正相關(guān)性。Bcl－2基因是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一，可抑制細(xì)胞凋亡。Bcl－2通過(guò)阻斷程序性細(xì)胞死亡信號(hào)傳遞系統(tǒng)的最后的共同通道而抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活，因而它是一種重要的細(xì)胞生存基因。Bcl－2蛋白和突變型p53蛋白的過(guò)度表達(dá)可引起腫瘤等許多疾病，使之成為治療這些疾病的藥物作用的重要靶位。在惡性腫瘤細(xì)胞中，突變型p53蛋白和Bcl－2蛋白過(guò)度表達(dá)［2－5］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，齊墩果酸能下調(diào)S－180荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)Bcl－2蛋白和突變型p53蛋白的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤的作用，其機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

［1］ 王奇，蘆柏震.齊墩果酸的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥房，2008，19(9):711－712.

［2］ 宋旭紅.阿魏蘑菇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞p53表達(dá)的影響［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2003，19(6):690 －691.

［3］ 應(yīng)小平，史迎麗，郭蘭生，等.山仙顆粒對(duì)小鼠S－180肉瘤的抑瘤作用及bcl－2基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.陜西中醫(yī)，2006，27(12):1588－1590.

［4］ 周忠光，白云，趙鑫，等.蝙蝠葛酚性堿對(duì)BxPC－3荷瘤裸鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53蛋白表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(2):31－33.

［5］ 尹麗穎，邊曉燕，肖洪彬，等.遼東楤木葉總皂苷對(duì)H22荷瘤小鼠p53及PCNA蛋白表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(1):18－20.