楊志欣，孟永海，王秋紅，楊炳友，匡海學(xué)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥性味理論指導(dǎo)中醫(yī)臨床用藥幾千年，其成果極為豐厚。然而，由于其理論自身哲學(xué)氣息濃厚，內(nèi)容缺乏客觀、規(guī)范化的評(píng)價(jià)體系，導(dǎo)致性味理論對(duì)現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)的指導(dǎo)意義呈下降趨勢(shì)。因此，如何使深刻而豐富的性味理論得到科學(xué)的詮釋是我們面臨的迫切任務(wù)。遵循中醫(yī)藥學(xué)基本理論，本課題組提出了“中藥一味一性，一藥X味Y性(Y≤X)”的假說和基于中藥性味可拆分性和可組合性的研究思路，并構(gòu)建了中藥性味理論研究的新模式［1－2］。吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸［Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.］、石虎［Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinaLis(Dode)Huang］或疏毛吳茱萸［Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang］的干燥近成熟果實(shí)。2010年版《中國藥典》收載吳茱萸:辛、苦，熱。為闡明吳茱萸辛味和苦味的物質(zhì)基礎(chǔ)，我們采用與吳茱萸性味功效相關(guān)的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗胃潰瘍、止嘔、止瀉等復(fù)合藥理學(xué)指標(biāo)作為吳茱萸性味功效評(píng)價(jià)體系，對(duì)吳茱萸的各化學(xué)拆分組分的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行了研究［3－5］。本文報(bào)道吳茱萸化學(xué)拆分組分的抗胃潰瘍作用結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大白鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(190±10)g，合格證號(hào)為P00102007，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供。

1.2 儀器與藥品

冰凍切片機(jī)(AT1720，日本立洋公司);光學(xué)顯微鏡(上海齊躍生物科技有限公司);吳茱萸購自哈爾濱市藥材公司(產(chǎn)地:貴州銅仁)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源學(xué)教研室王振月教授鑒定為疏毛吳茱萸［Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var bod － inieri(Dode)Huang］的干燥近成熟果實(shí);藥理實(shí)驗(yàn)樣品(蒸餾水;吳茱萸水煎液;7個(gè)化學(xué)拆分組分，實(shí)驗(yàn)室制備［3］);肝素鈉注射液(Heparin Sodium Injection，批號(hào)0507112，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司);乙醚等試劑均為分析純。

2 方法［6］

2.1 對(duì)應(yīng)激型胃潰瘍的影響

Wistar大白鼠90只，雌雄各半，隨機(jī)分為9組，每組10只。分組為蒸餾水空白對(duì)照組、吳茱萸水煎液組、吳茱萸內(nèi)酯組、生物堿1組、生物堿2組、醇沉組、20%乙醇洗脫組、95%乙醇洗脫組和揮發(fā)油組。各組禁食12h后灌胃，按大鼠體重2ml/100g給藥，連續(xù)給藥4天。實(shí)驗(yàn)前，將大鼠禁食48h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)時(shí)，給藥30min后，用乙醚輕麻大鼠，將動(dòng)物仰臥固定于大鼠固定鋼板上，將其下半身置于(20±1)℃的冷水，水面齊劍突水平，5h后處死大鼠，打開腹腔，暴露胃。先結(jié)扎賁門，再由十二指腸經(jīng)幽門向胃內(nèi)注入1%甲醛固定液6mL(固定15min)，然后結(jié)扎幽門，剪下胃，浸泡于同一濃度的甲醛中20min。沿胃大彎剪開并展平，用小棉球輕輕將黏膜上的黏液和血塊擦掉，觀察黏膜損傷程度。石蠟包埋胃組織行4μm切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，光鏡下觀察黏膜組織學(xué)改變。

按Guth標(biāo)準(zhǔn)［7］計(jì)算潰瘍指數(shù)(UI):點(diǎn)狀出血為1分，線狀出血長度＜1mm為2分，1～2mm為3分，2～4mm為4分，＞4mm為5分，寬度＞1mm時(shí)分值×2。并按照下列公式計(jì)算胃潰瘍抑制率。

2.2 對(duì)幽門結(jié)扎胃潰瘍的影響

Wistar大鼠90只，雌雄各半，隨機(jī)分為9組，每組10只。分組同2.1。每天給予大鼠相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥4天，第4天各組給相應(yīng)藥物后，禁食48h(禁食期間將動(dòng)物置于底部升高的大孔金屬濾網(wǎng)的籠中，以防止其食糞和墊料;禁食期間不禁水)，末次給藥提前2h。48h后，將大鼠置于鐘罩內(nèi)，用乙醚麻醉后，固定在大鼠板上，自胸骨劍突下沿腹中線切開腹壁，切口約2～3cm，在左側(cè)肋緣部位，用指輕輕往上一推，使胃暴露于切口。在幽門下穿一線將幽門結(jié)扎(鄰近的其它血管不結(jié)扎)，結(jié)扎后各組大鼠均經(jīng)十二指腸注射藥液1次，潰瘍模型組注射同等容積的蒸餾水，然后縫合腹壁切口，用生理鹽水清洗，注射青霉素鈉5萬u/只。

縫合后，將動(dòng)物單獨(dú)置于底部升高的大孔金屬濾網(wǎng)的飼養(yǎng)籠中，禁食水。經(jīng)18h后各組大鼠處死，結(jié)扎賁門，將胃取出，打開幽門或食道結(jié)扎端，收集胃液于刻度離心管中，以3 000rp/min速度離心20min。取上清胃液1mL，加酚紅指示劑1滴，用0.01mol/L NaOH滴定，直至胃液先呈黃色再轉(zhuǎn)為紅色2s內(nèi)不消失為終點(diǎn)，記錄用去的NaOH量，按照下列公式計(jì)算胃總酸度［8］。

總酸度(mmol/L)=耗去的NaOH量×10

按照改良Mett法測(cè)定胃液胃蛋白酶活性［9］:取內(nèi)徑為0.9～1.1mm的毛細(xì)玻璃管(10cm長)，洗凈烘干。取適量的雞蛋清，充分?jǐn)噭蚝笥枚蛹啿歼^濾。將毛細(xì)玻璃管利用虹吸作用灌滿蛋清(內(nèi)無氣泡)后，置85℃恒溫水浴中使蛋清凝固，制成蛋白管。冷卻后，用石蠟將毛細(xì)管兩端封固，置冰箱中備用。取上述每只大鼠胃液上清液1mL，加入0.05mol/L鹽酸8mL搖勻。每瓶中放入長約5cm的蛋白毛細(xì)管2根，塞好瓶口，于37℃的恒溫箱放置24h后，取出毛細(xì)管，用游標(biāo)卡尺測(cè)量毛細(xì)管兩端的透明長度，求平均值，計(jì)算胃蛋白酶活性，胃蛋白酶活性(kU/L)=平均值2×16。

潰瘍指數(shù)(UI)測(cè)定:由打開端注入10%甲醛溶液5mL，固定20min，沿胃大彎切開胃壁，清洗胃內(nèi)容物，展開胃壁，用小棉球輕輕將胃黏液及血凝塊擦掉，觀察胃黏膜損傷的程度和形態(tài)。按Guth標(biāo)準(zhǔn)［7］計(jì)算潰瘍指數(shù)(UI)，并計(jì)算胃潰瘍抑制率(同2.1)。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)應(yīng)激型胃潰瘍的影響

3.1.1 模型大鼠胃肉眼及光鏡觀察

冷水對(duì)大鼠應(yīng)激刺激后，取大鼠胃肉眼觀察:大鼠胃底部黏膜大片瘀血、出血嚴(yán)重，潰瘍面較多;胃黏膜病理切片經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察:胃黏膜上皮有缺損，胃底腺上皮細(xì)胞變性、壞死，黏膜層和黏膜下層偶見紅細(xì)胞及含鐵血黃素顆粒，黏膜下層偶見中性白細(xì)胞浸潤。

3.1.2 對(duì)應(yīng)激型胃潰瘍的潰瘍指數(shù)影響

以潰瘍指數(shù)作為指標(biāo)衡量作用效果，結(jié)果見表1。吳茱萸水煎液對(duì)應(yīng)激型胃潰瘍的潰瘍指數(shù)與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。各化學(xué)拆分組分中揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分、醇沉組分與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。

3.1.3 給藥后模型大鼠胃肉眼及光鏡觀察

模型大鼠胃肉眼觀察，給予吳茱萸水煎液、揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分、醇沉組分后，大鼠胃黏膜出血明顯減少，且潰瘍部位面積縮小;其余各組對(duì)潰瘍改善不顯著。

表1 吳茱萸及各化學(xué)拆分組分對(duì)應(yīng)激型胃潰瘍的潰瘍指數(shù)影響(±s，n=10)

表1 吳茱萸及各化學(xué)拆分組分對(duì)應(yīng)激型胃潰瘍的潰瘍指數(shù)影響(±s，n=10)

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量(g/kg)潰瘍指數(shù)(UI)抑制率(%)－ 35.6 ±11.1 －吳茱萸水煎液 1.35 11.0±3.2＊＊ 68.8揮發(fā)油組分 1.35 14.7±4.4＊＊ 58.7吳茱萸內(nèi)酯組分 1.35 22.4 ±7.0* 37.1生物堿1 組分 1.35 33.4 ±11.8 6.2 95%乙醇洗脫組分 1.35 28.9 ±8.6 18.8醇沉組分 1.35 17.3±5.8＊＊ 51.4生物堿2 組分 1.35 30.8 ±12.8 13.5 20% 乙醇洗脫組分空白對(duì)照1.35 31.0 ±10.0 12.9

模型大鼠胃黏膜病理切片經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察:給予吳茱萸水煎液、揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分、醇沉組分，可見大鼠胃底腺上皮細(xì)胞基本完好，未見黏膜下層中性粒細(xì)胞浸潤等變化。其余各組具有不同程度的黏膜充血、糜爛及炎細(xì)胞浸潤。

3.2 對(duì)幽門結(jié)扎胃潰瘍的影響

對(duì)幽門結(jié)扎大鼠胃潰瘍的潰瘍指數(shù)、總酸度及胃蛋白酶活性等的作用結(jié)果見表2。結(jié)果表明，吳茱萸水煎液、揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分均能降低潰瘍指數(shù)，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05);其余各化學(xué)拆分組分與模型組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。吳茱萸水煎液、揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分能降低大鼠胃液胃蛋白酶活性，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，對(duì)胃酸影響與模型組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，生物堿2組分可降低胃酸度，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

表2 吳茱萸及各化學(xué)拆分組分對(duì)幽門結(jié)扎胃潰瘍的影響(±s，n=10)

表2 吳茱萸及各化學(xué)拆分組分對(duì)幽門結(jié)扎胃潰瘍的影響(±s，n=10)

注:與模型對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量(g/kg) 總酸度(mmol/L) 胃蛋白酶活性 潰瘍指數(shù)(UI) 抑制率(%)77.1 ±16.2 405.2 ±151.3 53.7 ±18.0 －吳茱萸水煎液 1.35 67.3 ±14.7 203.1 ±78.1＊＊ 32.6 ±14.0* 39.3揮發(fā)油組分 1.35 61.9±21.5 173.8±89.8＊＊ 29.0±5.0＊＊ 46.0吳茱萸內(nèi)酯組分 1.35 66.9 ±16.5 242.6 ±73.8* 38.8 ±11.0* 27.7生物堿1 組分 1.35 64.9 ±14.1 373.5 ±117.6 45.5 ±19.8 15.3 95%乙醇洗脫組分 1.35 71.4±14.3 425.3±142.6 66.2±21.5 －23.3醇沉組分 1.35 62.9 ±15.5 328.0 ±115.0 41.0 ±13.3 23.6生物堿 2 組分 1.35 58.7 ±14.1* 303.4 ±61.7 42.0 ±8.8 21.9 20%乙醇洗脫組分模型對(duì)照 －1.35 64.4 ±18.3 367.1 ±61.6 44.5 ±15.1 17.1

4 討論

關(guān)于實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型的選擇［6］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)胃潰瘍的發(fā)病機(jī)制與胃酸和胃蛋白酶的消化能力及胃黏膜屏障功能失調(diào)有關(guān)。精神情緒、應(yīng)激狀態(tài)、藥物和飲食等則則引起胃潰瘍的誘因，據(jù)此學(xué)者們通過化學(xué)、物理以及應(yīng)激等手段制備成功了許多胃潰瘍模型。

藥理實(shí)驗(yàn)中常用的動(dòng)物模型有:1)應(yīng)激型胃潰瘍:用水或寒冷刺激，使皮層中樞的興奮及抑制過程失調(diào)，引起植物神經(jīng)調(diào)節(jié)紊亂而導(dǎo)致潰瘍形成。本法誘發(fā)潰瘍成功率高，方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，重復(fù)性好。2)幽門結(jié)扎型潰瘍:在麻醉無菌操作下結(jié)扎幽門，使胃液滯留胃中，胃壁防御機(jī)能減弱導(dǎo)致潰瘍形成。3)藥物誘發(fā)型潰瘍:消炎痛及阿斯匹林潰瘍模型—抑制胃黏膜環(huán)氧化酶，使前列腺素(對(duì)胃黏膜細(xì)胞有保護(hù)作用并能抑制胃酸分泌)合成減少，致胃黏膜細(xì)胞屏障機(jī)能減弱，胃酸增高而誘發(fā)潰瘍;組胺潰瘍模型—組胺可引起高酸度胃液大量分泌;利血平潰瘍模型—利血平可使兒茶酚胺耗竭，迷走神經(jīng)興奮性相對(duì)提高，使胃液分泌增多胃黏膜缺血而致潰瘍。4)醋酸損傷型潰瘍:用醋酸直接作用于胃壁組織而形成潰瘍。

前三種為急性潰瘍模型，通常在給予誘因后4～12h發(fā)生，因制備方法簡(jiǎn)便，故應(yīng)用較多。其中幽門結(jié)扎為Shay＇s傳統(tǒng)經(jīng)典大鼠胃潰瘍模型法;胃潰瘍疾病在中醫(yī)辨證中脾胃虛寒證居多，而對(duì)吳茱萸而言，其“性”偏熱，故其模型選擇上以通過“寒邪”應(yīng)激引發(fā)較為適合，因此本研究選用了上述兩種實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型。

應(yīng)激型胃潰瘍實(shí)驗(yàn)中，揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分、醇沉組分表現(xiàn)出良好的治療作用;幽門結(jié)扎胃潰瘍實(shí)驗(yàn)中，揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分同樣表現(xiàn)出治療作用。綜上，吳茱萸抗胃潰瘍物質(zhì)基礎(chǔ)為揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分、醇沉組分。

幽門結(jié)扎胃潰瘍實(shí)驗(yàn)中，胃蛋白酶的測(cè)定結(jié)果提示吳茱萸水煎液、揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分抗胃潰瘍的機(jī)理與降低胃蛋白酶活性有關(guān)。生物堿2組分雖然對(duì)胃潰瘍沒有顯著治療作用，但可以顯著降低胃酸度，提示在胃潰瘍的治療中如果將其組合到其他組分中可能會(huì)有更好的協(xié)同治療作用。

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［3］ 楊志欣，孟永海，王秋紅，等.吳茱萸化學(xué)拆分組分的性味藥理學(xué)評(píng)價(jià)－化學(xué)拆分組分的制備及其鎮(zhèn)痛作用的研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(4):11 －14.

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