陳浩，王玉蓉，孫毅坤，周洪偉，黃秀榮，戴俊東

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

多藥耐藥(MDR)［1］仍然是腫瘤治療的主要挑戰(zhàn)，固有和獲得的MDR可在多種腫瘤中發(fā)生，尤其是廣譜抗癌藥的代表阿霉素(Doxorubicin，DOX)，MDR是導(dǎo)致其癌癥治療失效的主要原因。目前較常用的抗耐藥方法是使用耐藥逆轉(zhuǎn)劑，近來(lái)研究表明，槲皮素(Quercetin，QUE)不但能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，還能調(diào)節(jié)CYP3A4及P－糖蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)MDR的活性［1－4］，但 QUE 水 溶 性 差，在 水 中 溶 解 度 僅 為0.047mg/mL［5］，要發(fā)揮療效往往需要應(yīng)用一定的制劑技術(shù)來(lái)增溶以提高其生物利用度。脂質(zhì)體作為抗腫瘤藥物的優(yōu)良載體，既能提高QUE的溶解度，又能靶向腫瘤細(xì)胞以降低DOX的心臟毒性［6］，故制備DOXQUE復(fù)方脂質(zhì)體(DQ－Lip)，兩藥合用的同時(shí)利用脂質(zhì)體的滲透滯留增強(qiáng)效應(yīng)(EPR)［7］靶向于腫瘤部位，降低腫瘤細(xì)胞的MDR，提高療效。

1 材料與儀器

槲皮素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100081－200406，純度:97.3%);槲皮素(四川協(xié)力有限公司，批號(hào)090503);鹽酸阿霉素(北京華豐科技有限公司，批號(hào)HF090516);氫化大豆磷脂SPC－3(Lipoid);膽固醇(Sigma);除高效液相分析所用試劑為色譜純外;其它試劑均為分析純;核跡聚碳酸酯微孔濾膜(英國(guó)Waters公司)。

RE－52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮);SCIENTZ－IID型超聲波細(xì)胞粉碎儀(浙江新芝);NANO－CS型動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀(美國(guó)馬爾文);JEM－1230型透射電鏡(日本JEOL);TU－1810APC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用);SPD－20A型高效液相色譜儀(日本島津);DL－5－B型離心機(jī)(上海安亭);XL－90型超速離心機(jī)(美國(guó)BeckMan)。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的制備 采用硫酸銨梯度法［8］制備DQ－Lip:取處方量氫化大豆磷脂、膽固醇、槲皮素(HSPC∶CH=3∶1mol/mol、HSPC∶QUE=20∶1mol/mol)，溶于9mL無(wú)水乙醇中，置于250mL梨形瓶?jī)?nèi)，40℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無(wú)水乙醇，形成均勻透明薄膜，加入0.15mol/L硫酸銨溶液10mL，75℃水浴常壓旋轉(zhuǎn)水化30min，使磷脂充分溶脹水合。所得淡黃色混懸液經(jīng)探頭超聲(600W)9min，再依次經(jīng)0.8μm、0.4μm核跡聚碳酸酯膜擠出各5次整粒，即得淡黃色的槲皮素脂質(zhì)體(QUE－Lip)［9］。放置過(guò)夜后置于透析袋(分子量8 000～14 000M)中，放入300mL生理鹽水，冰水浴下560rpm磁力攪拌10h，每40min更換1次生理鹽水，充分形成硫酸銨梯度;再與2mg/mL的DOX 溶液 1∶1(v/v)混合(DOX:HSPC=1∶7.9w/w)，55℃水浴孵育25min，取出后冰水浴冷卻，即得DQLip。

2.2 脂質(zhì)體包封率測(cè)定 采用超速離心法測(cè)定脂質(zhì)體中DOX與QUE的包封率。精密量取DQ－Lip溶液0.1mL，置于5mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻;取適量至離心管內(nèi)，以200 000g保持4℃恒溫超速離心2h，精密量取上清液1mL，置于5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣15μl，HPLC法測(cè)定其中 DOX、QUE 的含量 W1。另精密量取DQ－Lip溶液0.1mL，直接用甲醇溶解并稀釋至25mL，依法測(cè)定其中DOX、QUE的總含量W2。

RP－HPLC色譜條件:色譜柱:Kromasil C－18柱(4.6 ×250mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇:乙腈:PBS(pH 3.8)=19∶29∶52;流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):254nm。

2.3 脂質(zhì)體粒度分布測(cè)定 采用馬爾文動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀檢測(cè)平均粒徑(A－Size)和多分散系數(shù)(PDI)。激光束波長(zhǎng)633nm，入射與散射光束夾角173°，溫度25℃。取100μL脂質(zhì)體溶液用水稀釋至1.5mL，搖勻平衡3min后測(cè)定。

2.4 脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)考察 采用負(fù)染透射電鏡觀察。將樣品稀釋至適當(dāng)濃度后，滴于300目銅網(wǎng)表面，5min后用濾紙吸去多余液體，加入1滴2%磷鎢酸溶液(pH 7.0)染色5min，濾紙吸去多余液體，自然晾干后測(cè)定。

2.5 脂質(zhì)體制備工藝研究

2.5.1 孵育包封DOX對(duì)脂質(zhì)體粒徑及QUE包封率的影響 取QUE－Lip，65℃水浴孵育包封DOX制備DQ－Lip。取包封DOX前后的樣品照2.3項(xiàng)下方法測(cè)定粒度分布，結(jié)果如圖1所示:平均粒徑從174.8nm降低至 151.8nm，PDI從 0.622 降低至 0.383，表明加熱孵育DOX對(duì)脂質(zhì)體的粒度無(wú)負(fù)影響。取包封DOX前后的樣品照2.2.4項(xiàng)下方法操作，測(cè)定QUE的包封率。結(jié)果表明，包封DOX后QUE的包封率從94.7%下降至80.7%，說(shuō)明孵育加熱會(huì)造成已包封于磷脂雙分子層內(nèi)的部分QUE泄漏，從而降低QUE的包封率。

2.5.2 孵育溫度對(duì)DOX包封率的影響 將形成硫酸銨梯度的QUE－Lip與2mg/mL阿霉素溶液1:1 v/v混合(DOX∶HSPC=2∶7.9w/w)，分別于 45℃、55℃、65℃水浴條件下孵育25min，取出后冰水浴冷卻，考察孵育溫度對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，在55℃水浴條件下孵育DOX的包封率最高。

表1 包封溫度對(duì)DOX包封率的影響 (n=3)

2.5.3 藥脂比與硫酸銨濃度對(duì)DOX包封率的影響

分別采用不同藥脂比的QUE(QUE∶HSPC=1∶15、1∶20mol/mol)和硫酸銨梯度(濃度為 0.15mol/L、0.25mol/L)制備QUE－Lip;然后于55℃水浴孵育包封不同藥脂比的 DOX(DOX:HSPC=1∶7.9、2∶7.9w/w)制備DQ－Lip，考察各因素對(duì)DOX包封率的影響。結(jié)果表明(表2)，隨脂質(zhì)體中QUE和DOX藥脂比的增加，DOX的包封率下降;而增大硫酸銨梯度有助于提高DOX的包封率。

圖1 包封DOX對(duì)脂質(zhì)體粒徑的影響

表2 藥脂比與硫酸銨梯度對(duì)DOX包封率的影響 (n=3)

2.5.4 DQ－Lip制備工藝驗(yàn)證 選擇QUE藥脂比為1:20mol/mol、水化硫酸銨濃度為0.15mol/L，55℃水浴孵育包封DOX(藥脂比1:7.9w/w)，重復(fù)制備3批DQ－Lip。經(jīng)檢測(cè)，DOX與QUE的包封率分別為(90.6±0.61)% 和(83.3 ± 0.24)%，RSD 分別為 0.29% 和0.68%(n=3);DQ－Lip的平均粒徑為138.5nm，PDI為 0.264，分布均勻，粒度圓整(圖2、圖3)。

3 討論

硫酸銨梯度法制備脂質(zhì)體中，脫鹽形成硫酸銨梯度的方法主要為葡聚糖凝膠柱層析法(包含微柱離心法)和透析法。對(duì)于凝膠柱層析法而言，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，QUE會(huì)與葡聚糖凝膠G－50強(qiáng)烈吸附，采用水、生理鹽水、PBS緩沖液等方法均難以洗脫;同時(shí)柱層析法在一定程度上會(huì)造成脂質(zhì)體的稀釋?zhuān)焕贒Q－Lip的制備。透析法雖然耗時(shí)較長(zhǎng)，但操作簡(jiǎn)便，能在不稀釋脂質(zhì)體的前提下充分脫鹽，在脂質(zhì)體膜內(nèi)外形成足夠的硫酸銨梯度，從而保證DOX的高包封，因而本文采用透析法制備DQ－Lip。

圖2 DQ－Lip粒度分布結(jié)果

脂質(zhì)體中藥物包封率是其質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，測(cè)定方法需根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況進(jìn)行選擇。其常用的測(cè)定方法包括透析法、葡聚糖凝膠柱層析法、魚(yú)精蛋白沉淀法和高速離心法。其中，透析法所需樣品量大，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，主要用于水溶性藥物的測(cè)定，對(duì)QUE等疏水性藥物不適用;QUE會(huì)與G－50強(qiáng)烈吸附，故凝膠柱層析法也不適于本實(shí)驗(yàn);魚(yú)精蛋白沉淀法主要用于負(fù)電荷脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體中藥物包封率的測(cè)定［10］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DOX電離后形成的陽(yáng)離子會(huì)吸附于DQ－Lip表面，降低帶正電荷的魚(yú)精蛋白對(duì)脂質(zhì)體的絮凝作用，使脂質(zhì)體沉淀不完全，以致藥物包封率測(cè)定結(jié)果偏低。綜上，本實(shí)驗(yàn)最終確定以經(jīng)典的高速離心法測(cè)定DQ－Lip中DOX與QUE的包封率，結(jié)果表明此法可行，所得結(jié)果準(zhǔn)確。

圖3 DQ－Lip透射電鏡照片

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