王秀梅，姚菲菲，孫立秋，崔蕊，王莉

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150016)

腹膜炎是腹膜透析(Peritoneal Dialysis，PD)患者終止透析的最主要原因，對(duì)慢性腎衰PD患者的生活質(zhì)量和治療效果影響嚴(yán)重。有效降低腹膜透析性腹膜炎的發(fā)生的治療方法，一直是腎替代研究領(lǐng)域的重要研究課題。近年來，中草藥在PD中的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注，成為中西醫(yī)結(jié)合的一個(gè)重要研究方向［1－2］。在本研究中我們將中藥麥冬注射液加入腹透液中，觀察其對(duì)腹膜透析性腹膜炎動(dòng)物模型腹腔防御功能各項(xiàng)指標(biāo)的影響，為中草預(yù)防PD性腹膜炎尋找有效的藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(350±41)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。1.2 藥物 1.5%腹透液(百特公司，批號(hào)G1004048);麥冬注射液(含生藥1g/ml，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室提供);大腸桿菌(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院細(xì)菌室提供)。

1.3 動(dòng)物分組 隨機(jī)法將40只SD大鼠分為模型麥冬透析組(A組)10只、模型常規(guī)透析組(B組)10只、正常麥冬透析組(C組)10只、正常常規(guī)透析組(D組)10只，共4組，模型麥冬透析組造模成功后應(yīng)用含生藥1g/ml麥冬注射液的腹透液透析;模型常規(guī)透析組造模后使用普通腹透液透析;正常麥冬透析組不造模，使用含生藥1g/ml麥冬注射液的腹透液透析;正常常規(guī)透析組不造模，使用普通腹透液透析。

1.4 腹膜炎模型制作及透析方法 實(shí)驗(yàn)第1天，兩個(gè)模型每只大鼠在無菌條件下從左下腹注入大腸桿菌1×106個(gè)，隨即4組大鼠均開始透析。參照文獻(xiàn)［3］，用前使用恒溫箱將1.5%腹透液加熱至38℃，嚴(yán)格消毒大鼠腹部，分別將上述不同配方的腹透液25m1用8號(hào)針頭注入腹腔。2h后用12號(hào)針頭將透析液通過放出，每只大鼠每天1次，連續(xù)7天。

1.5 巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè) 按照文獻(xiàn)［4］所述方法。1)Alserver＇s保存液配制:電子分析天平稱取枸櫞酸三鈉·2H2O 2.4g，葡萄糖6.15g，氯化鈉 1.26g，置小燒杯中，加300mL蒸餾水，過濾分裝，高壓滅菌20min，儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。2)雞紅細(xì)胞懸液的配制:15mL血在無菌條件下取自雞翼下靜脈，置100mL疫苗瓶中，加入5倍的Alsemer＇s保存液中，放4℃冰箱。使用前先用生理鹽水洗滌雞紅細(xì)胞懸液3次，1 500r/min 5min離心2次，棄上清液和界面的白細(xì)胞層。最后連續(xù)2次離心(2 000r/min，5min)，離心至壓積恒定，并用生理鹽水將雞紅細(xì)胞懸液配成3%(V/V)。3)在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第8天晨消毒大鼠后，將3%雞紅細(xì)胞懸液2mL腹腔注射每只大鼠，注射后1h后斷頸處死后輕微翻動(dòng)，吸取每只腹腔液，涂布于載玻片上，每只大鼠涂片4～5張，放置于墊有濕紗布的搪瓷盆內(nèi)，在37℃溫育30min，以生理鹽水漂洗，洗去未被吞噬的雞紅細(xì)胞及其他無關(guān)細(xì)胞，吹風(fēng)機(jī)吹干，置于甲醇、1∶1丙酮溶液固定5min，4%Giemsa－wright染液染色 3min，吹干后在油鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞數(shù)，即為所吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)，以此計(jì)算出吞噬百分?jǐn)?shù)及吞噬指數(shù)。

1.6 一般情況觀察 從實(shí)驗(yàn)開始連續(xù)觀察各組動(dòng)物的精神狀態(tài)、大小便次數(shù)、進(jìn)食情況，有無煩躁、寒戰(zhàn)等一般情況。

1.7 指標(biāo)檢測(cè) 透析至第7天時(shí)各組透出液分別送檢腹透液常規(guī)、腹透液細(xì)菌培養(yǎng)加細(xì)菌落計(jì)數(shù)。第8天各組送檢巨噬細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠一般情況及癥狀變化 模型麥冬透析組(A組)、模型常規(guī)透析組(B組)在造模后3天內(nèi)分別出現(xiàn)不同程度精神萎靡、活動(dòng)量減少，但發(fā)現(xiàn)有寒戰(zhàn)、煩躁、進(jìn)食減少等其他臨床癥狀。在3天后，精神、活動(dòng)量也恢復(fù)正常，其他兩組未見異常表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組大鼠成活只數(shù)為A組8只，B組7只，C組8只，D組9只。

2.2 各組透析第7天腹腔液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果 細(xì)菌培養(yǎng)僅模型麥冬透析組(A組)和模型常規(guī)透析組(B組)各有一個(gè)腹透液樣本大腸桿菌為陽性，其余樣本均呈陰性。

2.3 透析至第7天各組大鼠腹透液中白細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞分類和蛋白質(zhì)濃度 如圖1顯示，模型麥冬透析組(A組)、正常麥冬透析組(C組)及正常常規(guī)透析組(D組)腹透液中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著低于模型常規(guī)透析組(P＜0.05或P＜0.01)，而A、C、D組間比較各項(xiàng)指標(biāo)無顯著性差異;各組腹透液蛋白質(zhì)濃度比較無明顯差異(均P＞0.05)。

2.4 透析第8天各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能變化情況 如圖2顯示，模型常規(guī)透析組(B組)的巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)均低于模型麥冬透析組(A組)、正常麥冬透析組(C組)及正常常規(guī)透析組(D組)(P＜0.05或P＜0.01);正常麥冬透析組的吞噬百分率明顯高于常規(guī)透析正常組，而兩組的吞噬指數(shù)則差異無顯著性。

圖1 各組腹透液白細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞分類及蛋白質(zhì)濃度變化

圖2 各組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能變化比較

2.5 第8天各組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能變化情況

圖2顯示，常規(guī)透析模型組的巨噬細(xì)胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)低于麥冬透析模型組、麥冬透析正常組及常規(guī)透析正常組(P＜0.05或P＜0.01);麥冬透析正常組的吞噬百分率高于常規(guī)透析正常組，而兩組的吞噬指數(shù)則無顯著性差異。

3 討論

腹膜透析是終末期腎臟病二大替代治療之一，其優(yōu)點(diǎn)和獨(dú)到之處已經(jīng)逐漸被人們接受，在透析的前2～4年治療中，患者生存優(yōu)勢(shì)明顯超過了血液透析［5］。甚至有些學(xué)者認(rèn)為，是終末期腎臟病的首選透析方法［6］。腹膜炎是腹膜透析患者終止透析的主要原因，其發(fā)生除與各種操作因素、內(nèi)外環(huán)境因素等密切相關(guān)外，環(huán)境因素中腹腔防御功能的減退是腹膜透析并發(fā)腹膜炎的重要原因。從此內(nèi)因出發(fā)，通過在腹透液中加入某些免疫調(diào)節(jié)因子，用以增強(qiáng)腹腔防御功能是防治腹膜炎并發(fā)癥的有效方法［7］。近年來向腹透液加入具有免疫調(diào)節(jié)作用的中藥制劑預(yù)防腹膜炎的發(fā)生，受到越來越多的重視。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，麥冬多糖可以促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫功能，并誘生多種細(xì)胞因子。顯著增加小鼠脾重量、增強(qiáng)小鼠碳粒廓清的作用(增加小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬能力)。麥冬通過一定的免疫促進(jìn)作用對(duì)荷瘤小鼠具有一定的抑瘤譜及抑瘤強(qiáng)度，其作用機(jī)制與麥冬能夠提高NK細(xì)胞的活性有關(guān)。同時(shí)在促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)、增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫和機(jī)體抵抗力等方面，麥冬也有明顯的作用［8－9］。基于以上事實(shí)，我們進(jìn)行了麥冬對(duì)腹膜透析腹膜炎的影響的研究。其中，確定藥物劑量是關(guān)鍵的步驟。在參閱了大量既往相似的研究后，我們以小劑量、不明顯影響腹透液的重要理化參數(shù)為原則，反復(fù)調(diào)試發(fā)現(xiàn)，含生藥1g/ml麥冬注射液的腹透液的各項(xiàng)指標(biāo)，諸如pH值、滲透壓及電解質(zhì)含量改變不明顯，故爾采用該濃度作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的觀察劑量。我們的研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果是一致的，即腹膜透析可致巨噬細(xì)胞的吞噬作用受到抑制，缺乏吞噬能力［10］。常規(guī)透析模型組的白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)明顯高于治療組模型麥冬透析組，表明腹腔給予麥冬注射液能夠降低腹膜透析腹膜炎的發(fā)病程度。本研究結(jié)果還顯示，模型麥冬透析組的巨噬細(xì)胞吞噬百分率、吞噬指數(shù)明顯高于模型常規(guī)透析組，進(jìn)一步提示該藥可能是通過免疫調(diào)節(jié)途徑，從而增強(qiáng)腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高了腹腔的防御機(jī)制，減少了腹膜炎的發(fā)生。正常麥冬透析組和正常常規(guī)透析組的白細(xì)胞數(shù)量及分類上兩項(xiàng)指標(biāo)無明顯差異，說明麥冬注射液在該劑量對(duì)腹腔無明顯的不良刺激性，不能引起腹腔的炎癥反應(yīng)。綜上，麥冬在預(yù)防腹膜透析性腹膜炎領(lǐng)域值得今后進(jìn)一步研究，以便在臨床中推廣應(yīng)用。

［1］ 吳一帆，劉旭.中醫(yī)藥干預(yù)腹膜透析的研究進(jìn)展［J］.四川中醫(yī)，2008，26(10):33 －35.

［2］ 厲月玲，李麗香.大黃導(dǎo)滯湯灌腸促進(jìn)急性彌漫性腹膜炎術(shù)后胃腸功能恢復(fù)的效果觀察［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(3):108 －109.

［3］ Hung KY，Huang JW，Chiang CK，et al.Preservation of peritoneal morphology and function by pentoxifylline in a rat model of peritoneal dialysis:molecular studies［J］.Nephrol Dial Transplant，2008，23(12):3831－3840.

［4］ 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991:158－159.

［5］ Quinn RR，Austin PC，Oliver MJ.Comparative studies of dialysis therapies should reflect real world decision － making［J］.J Nephrol，2008，21(2):139 －145.

［6］ Alloatti S，Manes M，Paternoster G，et al.Peritoneal dialysis compared with hemodialysis in the treatment of end－stage renal disease［J］.J Nephrol，2000，13(5):331 －342.

［7］ Chegini N.TGF － beta system:the principal profibrotic mediator of peritoneal adhesion formation［J］.Semin Reprod Med，2008，26(4):298－312.

［8］ 蔣鳳榮，張旭，范俊，等.麥冬藥理作用研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24(2):236 －237.

［9］ Dai HF，Mei WL.Ophiopojaponin D，a new phenylpropanophiopogon injectiond glycoside from Ophiopogon japonicus Ker－ Gawl［J］.Arch Pharm Res，2005，28(11):1236 －1238.

［10］ Wang Y，Chang Z.Heat－shock response down－regulates interleukin － 18 expression in murine peritoneal macrophages［J］.Biol Cell，2005，97(7):551－556.