王玉平，劉影哲，周亞濱，孫靜，于曉紅，楊建飛

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

動(dòng)脈粥樣硬化是以脂質(zhì)與纖維成分在大動(dòng)脈壁沉積為特征的慢性進(jìn)行性病變，目前對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但普遍認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，而MIF是重要的促炎性細(xì)胞因子中的一種。養(yǎng)心顆粒用于臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化(AS)已取得肯定療效［1］。養(yǎng)心顆粒是以明代王肯堂所著《證治準(zhǔn)繩》中養(yǎng)心湯為基礎(chǔ)研制而成，原方以益氣養(yǎng)心安神為法，由黃芪、人參、茯苓、當(dāng)歸等13味中藥配伍而成。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)易損斑塊家兔模型MIF含量水平的測(cè)定，探討中藥養(yǎng)心顆粒對(duì)穩(wěn)定斑塊的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性家兔24只，體質(zhì)量2.3～2.6kg，4～5月齡，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(HEI)2007003，均在通風(fēng)，溫度、濕度適宜的動(dòng)物室內(nèi)單籠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑 養(yǎng)心顆粒由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室制備成養(yǎng)心顆粒粉末，每克粉末含7g生藥，將中藥粉末加蒸餾水定期配制成混懸液，濃度為40%;辛伐他汀片(浙江京新藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)0908221);中國(guó)斑點(diǎn)蝰蛇毒(廣州蛇毒研究所);組胺(上海卓康生物科技有限公司，批號(hào) 100102);重組p53腺病毒注射液(深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字S20040004);MIF試劑盒(美國(guó)R＆D生物技術(shù)公司)。

1.3 儀器 手推式壓力器(愛爾蘭MERITMEDI公司);CR21型低溫高速離心機(jī)(日本日立公司);2.5mm×15mm PTCA球囊(日本TERU－MO公司);5F導(dǎo)管(日本TERUMO公司);穿刺針(日本TERUMO公司);SONOS7500型彩色多普勒超聲心動(dòng)圖儀(荷蘭飛利浦公司);MDF－U50V超低溫冰箱(日本日立公司);7170型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)。

1.4 造模分組 1)球囊損傷頸總動(dòng)脈內(nèi)膜［2］:術(shù)前禁食12h給予20%的烏拉坦(1.0g/kg)經(jīng)家兔耳靜脈麻醉，將頸部剪毛，碘伏酒精常規(guī)消毒，沿頸部正中切開皮膚，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)外動(dòng)脈的分叉，分離出左側(cè)頸外動(dòng)脈結(jié)扎遠(yuǎn)心端，“V”剪開頸外動(dòng)脈，自頸外動(dòng)脈向近心端插2.5mm×15mm球囊至頸總動(dòng)脈起始部，尾部連接手推式壓力泵，球囊內(nèi)注入生理鹽水，膨脹球囊后維持6個(gè)大氣壓持續(xù)約30s，自近心端緩慢拉回，反復(fù)3次退出球囊。于剪開處近端結(jié)扎頸外動(dòng)脈，局部噴灑慶大霉素，逐層縫合皮下組織及皮膚。術(shù)后連續(xù)3天肌肉注射青霉素。2)高脂飲食喂養(yǎng):頸總動(dòng)脈球囊損傷的家兔以高脂飼料(20%蛋黃粉、80%基礎(chǔ)飼料、外加1%膽固醇)喂養(yǎng)8周，經(jīng)彩色多普勒超聲檢測(cè)證實(shí)頸總動(dòng)脈粥樣斑塊形成。3)p53基因轉(zhuǎn)染［2－3］:麻醉動(dòng)物，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，以左頸外動(dòng)脈根部至其近心段4.0cm之間血管段作為轉(zhuǎn)染部位，夾閉其兩端，向該部位管腔中注入50μL重組人p53腺病毒注射液，10 min后恢復(fù)血供，關(guān)閉切口。術(shù)后常規(guī)預(yù)防感染3天。并于處死動(dòng)物前24～48h給予兩次藥物觸發(fā)，斑點(diǎn)蝰蛇毒0.15mg/kg腹腔下注射，耳緣靜脈注射組胺0.02mg/kg。將造模成功后家兔隨機(jī)分為模型對(duì)照組，養(yǎng)心顆粒組，辛伐他汀組，每組6只，另取6只為空白對(duì)照組。按人兔給藥劑量體表面積折算公式計(jì)算出給藥計(jì)量，各治療組給予藥物灌胃2周，養(yǎng)心顆粒組按0.643g/kg/d粉末給藥;辛伐他汀組按2.5mg/kg/d給藥，空白組及模型組灌服同體積蒸餾水。

1.5 標(biāo)本采集與處理 分別于實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)第8周末、10周末，用一次性5ml注射器快速而動(dòng)脈取血3ml注入試管中以3500轉(zhuǎn)/min離心15min，取血清，放入冰箱冷凍保存。按試劑盒說(shuō)明方法測(cè)定血漿巨噬細(xì)胞游走抑制因子(MIF)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)采用(±s)表示，組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析及配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組與空白對(duì)照組相比，各組在8周末MIF的含量升高(P＜0.01);10周末與本組8周末比較MIF含量降低(P＜0.01);10周末養(yǎng)心顆粒組與辛伐他汀組比較MIF含量降低(P＜0.01)。

表1 家兔MIF濃度變化的比較(±s，ng/mL)

表1 家兔MIF濃度變化的比較(±s，ng/mL)

注:8周末各組與空白對(duì)照組比較，☆P＜0.01;與8周末比較，▲P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01;與辛伐他汀組比較，★P＜0.01。

組別 n 8周末 10周末空白對(duì)照組6 23.00 ±2.44 22.12 ±2.59模型對(duì)照組 6 39.23±6.47☆ 38.67±6.13▲養(yǎng)心顆粒組 6 36.83±3.48☆ 25.57±3.81▲△★辛伐他汀組 6 37.38±6.29☆ 27.50±4.40▲△

3 討論

巨噬細(xì)胞游走抑制因子是較早發(fā)現(xiàn)的淋巴細(xì)胞因子之一，并一直認(rèn)為只有活化的T淋巴細(xì)胞才能產(chǎn)生。研究表明［4］，MIF主要來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞，是炎癥性疾病中的一種關(guān)鍵介質(zhì)，其可以通過誘導(dǎo)黏附分子的產(chǎn)生，抑制內(nèi)膜下聚集的巨噬細(xì)胞的移動(dòng)，促進(jìn)它們?cè)谘装Y部位集聚、增殖以及分泌炎性細(xì)胞因子，從而促進(jìn)粥樣斑塊的形成和進(jìn)展，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生。MIF增高可促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及進(jìn)展。

易損斑塊發(fā)生破裂或血栓形成可導(dǎo)致臨床急性冠狀動(dòng)脈事件的發(fā)生。而纖維帽強(qiáng)度是決定斑塊穩(wěn)定性的重要因素，纖維帽內(nèi)膠原減少則是引起纖維帽強(qiáng)度降低的主要原因。基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員可降解膠原，研究證實(shí)，MIF可以促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員的表達(dá)，參與減弱纖維帽厚度，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性增加。因此，MIF增高能夠促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定性增加［5］。

本實(shí)驗(yàn)擬觀察p53基因轉(zhuǎn)染易損斑塊家兔動(dòng)物模型組服用益氣養(yǎng)心安神法組成的中藥養(yǎng)心顆粒前后MIF水平的變化，分析它們之間的關(guān)系，探討?zhàn)B心顆粒穩(wěn)定斑塊的可能作用機(jī)制，為廣泛的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

［1］ 吳茜，肖杰.益氣活血、養(yǎng)心安神治療胸痹證54例［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2005，12(6):38.

［2］ 錢亞東，葉炳華，管耘園.球囊損傷、高脂喂養(yǎng)加野生型p53基因轉(zhuǎn)染建立兔頸動(dòng)脈易損斑塊模型［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2007，23(1):33－36.

［3］ 陳文強(qiáng)，張運(yùn)，張梅，等.外源性人野生型p53基因轉(zhuǎn)染導(dǎo)致兔動(dòng)脈硬化斑塊的不穩(wěn)定性［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84(1):43 －47.

［4］ 余細(xì)勇，陳紅梅，林秋雄，等.巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2007，15(7):555.

［5］ 楊麗霞，苗貴華，齊峰，等.冠心病患者血漿激活蛋白－1、巨噬細(xì)胞游走抑制因子水平和冠狀動(dòng)脈病變的關(guān)系［J］.中國(guó)介入心臟病學(xué)雜志，2009，17(5):263.