邢 影， 張文杰， 方 芳， 鄭昭石

(1吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林長春130033;2吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部生理教研室，吉林長春130021)

腦缺血損傷機(jī)制之一是細(xì)胞內(nèi)鈣超載，研究表明引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載的原因除細(xì)胞本身的變化外，還有電壓門控性鈣通道和N－甲基－D－天冬氨酸受體(N－methyl－D－aspartate receptor，NMDAR)依賴性鈣通道的參與[1，2]，然而對NMDAR拮抗劑的腦保護(hù)作用研究不盡人意[3]，使學(xué)者們的視線重新回到電壓門控性鈣通道和尋找其它類型的離子通道上。糖尿病是腦梗死獨立的危險因素之一。糖尿病基礎(chǔ)上的腦梗死癥狀重、多進(jìn)展，預(yù)后差，但其確切機(jī)制尚不清楚，目前相關(guān)研究較少。本研究從離子通道角度研究糖尿病加重腦梗死的可能機(jī)制，對進(jìn)一步加深糖尿病合并腦梗死的認(rèn)識及進(jìn)一步有效地干預(yù)具有重要意義。

材料和方法

1 動物、分組及主要試劑

雄性Wistar大鼠50只，體重220－240 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.1 分組 糖尿病組25只，正常組25只;根據(jù)局灶性腦缺血時間分為正常假手術(shù)組和單純?nèi)毖? h、3 h、6 h、24 h組，每組5只;糖尿病假手術(shù)組和糖尿病局灶性缺血1 h、3 h、6 h、24 h 組，每組 5 只;共 10組。

1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和鏈霉蛋白酶(pronase)購自Sigma，人工腦脊液及記錄鈣通道電流的細(xì)胞內(nèi)、外液為自配。

2 模型建立

2.1 糖尿病大鼠模型建立 高脂飲食4周后，參考文獻(xiàn)[4]并按照試劑說明，制備pH=4.2的檸檬酸緩沖液。按30 mg/kg稱取STZ，溶于檸檬酸緩沖液中，快速腹腔注射。7 d后尾靜脈取血，測空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。血糖高于30 mmol/L剔除實驗，隨機(jī)補(bǔ)充。

2.2 局灶腦缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型的建立 MCAO模型以 Zea－Longa等[5]法為標(biāo)準(zhǔn)，選用尼龍線栓塞左側(cè)大腦中動脈。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸部正中切口，找出左頸總動脈(left common carotid artery，LCCA)并游離，沿左側(cè)頸總動脈向頭端分離頸內(nèi)、外動脈。分離翼額動脈并在其根部結(jié)扎。在頸總與頸內(nèi)外動脈分叉處剪一小口，用0.28 mm的尼龍線插至顱內(nèi)，深約(18.0±0.5)mm，直至左側(cè)大腦前動脈，引起局灶性腦缺血。待動物清醒后，觀察神經(jīng)系統(tǒng)癥狀以判斷手術(shù)是否成功。參考文獻(xiàn)[5]的5分制法進(jìn)行評分。0分:無神經(jīng)損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走，意識喪失;5分:死亡。分值越高，說明動物癥狀越嚴(yán)重。造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn):以大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)右側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，提尾時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。1－3分為納入標(biāo)準(zhǔn)，0分、4分或死亡剔除，缺少的隨機(jī)補(bǔ)充。實驗中選取腦缺血24 h的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

3 大鼠腦皮層神經(jīng)元的急性分離

[6]于各時點大鼠斷頭取腦 ，快速移入冰冷(0－4℃)的孵育液中30－60 s，冷卻后在冰盤上取左側(cè)大腦半球缺血周圍組織，以振動切片機(jī)切成400－600 μm腦薄片，取皮層置于盛有孵育液中。室溫下孵育50 min，孵育過程中通入95%O2+5%CO2的混合氣后，移入濃度為0.4 g/L含有pronase的消化液中，32℃ 水浴消化30 min后用孵育液洗標(biāo)本3次，移入另一個盛有孵育液的干凈燒杯中，依次用口徑遞減的3個吸管輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液 ，豎直靜置約5 min，吸取上部細(xì)胞懸液 ，加入培養(yǎng)皿內(nèi)，約30 min細(xì)胞貼壁后用于實驗研究。

4 全細(xì)胞膜電流記錄方法

自配全細(xì)胞鈣通道電流所使用的浸溶液為(mmol/L):TEA － Cl 135，BaCl210，HEPES 10，葡萄糖10，pH用 TEA－OH 調(diào)整為7.4。電極溶液為(mmol/L):CsCl 130，MgCl21，EGTA 8，TEA － Cl 4，HEPES 4，ATP－Mg 4，磷酸肌酸 10，GTP －Li40.1，pH用TEA－OH調(diào)整為7.2。用兩次拉制法將毛坯拉成微電極，沖灌電極液后，電阻范圍為5－10 MΩ。將微電極緩緩插入浴液，接觸神經(jīng)元細(xì)胞，當(dāng)電極尖端與細(xì)胞膜表面形成1－5 GΩ封接電阻時，用力吸破電極尖端上的膜片，形成全細(xì)胞記錄。用Pclamp 6.03軟件，經(jīng)數(shù)/模 (1200 D/A，AXON)轉(zhuǎn)換卡，通過膜片鉗放大器(CEZ－2400)鉗制細(xì)胞的膜電位，記錄不同電壓條件下的離子通道電流(從－50到+60，每次階躍10 mV)。實驗中電流的記錄在全細(xì)胞方式穩(wěn)定5 min后進(jìn)行。并應(yīng)用Pclamp 6.03軟件采樣處理電流信號，采樣頻率為1 KHz，低通濾波器濾波頻率為3 kHz。細(xì)胞膜電容記錄方法:鉗制電壓為－80 mV，通過去極化脈沖使膜去極至－90 mV，時程為10 ms，通過積分計算得到單個細(xì)胞的膜電容。糖尿病腦缺血和單純腦缺血各鈣電流曲線來自不同細(xì)胞的不同時點，從保持點位階躍至－10 mV的最大電流。為便于比較，將不同時點的變化曲線整合于同一平面中。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.0軟件包，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用t檢驗;神經(jīng)功能評分的組間比較用非參數(shù)檢驗，所得數(shù)據(jù)用平均秩表示。

結(jié) 果

1 血糖結(jié)果

糖尿病大鼠空腹血糖為(19.70±2.38)mmol/L，符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 神經(jīng)功能評分

對糖尿病局灶腦缺血24 h及單純?nèi)毖?4 h大鼠進(jìn)行神經(jīng)評價，結(jié)果顯示糖尿病組大鼠術(shù)后清醒較晚，肢體偏癱程度重于單純?nèi)毖M，2組相比差異顯著(P＜0.05)，見表1。

表1 單純?nèi)毖c糖尿病局灶腦缺血24 h神經(jīng)功能評分Table 1.Score of nerve function of rats in DM+MCAO and MCAO groups(n=8)

3 急性分離的大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定

將急性分離后的貼壁細(xì)胞置于倒置顯微鏡(O-lympus)下，可以看到典型皮層神經(jīng)元表面光潔，細(xì)胞胞體多呈錐形，有2－3個樹突，且有一較長的軸突，見圖1。根據(jù)神經(jīng)元的形態(tài)可以斷定分離的細(xì)胞為皮層神經(jīng)元錐體細(xì)胞，選取形態(tài)飽滿的細(xì)胞用于實驗。

4 大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞電壓依賴性L－型鈣通道電流的鑒定

Figure 1.The cortical neurons by acute isolation under inverted microscope(×40).圖1 倒置顯微鏡下觀察急性分離的皮層神經(jīng)元

使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，將分離的皮層神經(jīng)元細(xì)胞鉗制在－50 mV，階躍命令為+10 mV，持續(xù)時間300 ms，鈣通道在去極化至－30 mV時被激活，最大內(nèi)向峰值鈣電流在－10 mV為(11.02±2.02)pA/pF;向浸溶液灌流10 μmol/L nifedipin后，同樣方法檢測分離的神經(jīng)元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在－10 mV為(7.08±2.08)pA/pF，可抑制大部分電流成分;相同的實驗條件向浸溶液灌流Bay K 8466 1 μmol/L，檢測分離完好的其他神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)在－20 mV為(20.42±3.40)pA/pF，明顯激活此電流，最大峰值電流向左偏移－10 mV，表明為L－型鈣通道電流，與文獻(xiàn)報道相符合[7]，見圖2(圖中顯示原始電流曲線為 －50、－30、－10、+10、+30、+50 mV 時對應(yīng)的電流，其結(jié)果來自同一大鼠的不同細(xì)胞，電流電壓關(guān)系曲線表示除以膜電容后的電流值)。

Figure 2.Primary current curves of calcium channel in cortex neurons of rats.A:control;B:nimodipine;C:Bay K 8644;D:I/V curves.圖2 大鼠大腦皮層鈣通道原始電流曲線

5 MCAO和DM+MCAO對大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞L型電壓依賴鈣通道的影響

應(yīng)用同樣實驗方法，實驗記錄了單純?nèi)毖吞悄虿【衷钅X缺血1、3、6和24 h缺血周圍皮層神經(jīng)元L型電壓依賴鈣通道電流的變化，表2所示，MCAO和DM+MCAO各組隨著缺血時間延長，L－電壓依賴型鈣通道電流明顯增高，與假手術(shù)組相比，P＜0.05;其中DM+MCAO各組的L－電壓依賴型鈣通道電流分別高于MCAO各組(P＜0.05)，見圖3、4。

表2 缺血各組大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞電壓依賴型鈣通道電流(pA/pF)Table 2.L－type voltage－gated Ca2+channel current of cortical neurons in ischemia groups(pA/pF.±s.n=8)

表2 缺血各組大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞電壓依賴型鈣通道電流(pA/pF)Table 2.L－type voltage－gated Ca2+channel current of cortical neurons in ischemia groups(pA/pF.±s.n=8)

*P＜0.05 vs MCAO.

Group Sham 1 h 3 h 6 h 24 h MCAO 11.02 ±2.02 12.19±1.2113.00 ±1.52 14.76±1.21 15.30±1.05 DM+MCAO 13.15 ±0.89*13.46±0.97*14.51 ±1.33*15.28±1.47*17.22±1.39*

Figure 3.Influence of different time of MCAO on calcium channel of cerebral cortex in rats.A:Ca2+channel current curves during different time of MCAO;B:I/V curves.圖3 單純?nèi)毖煌瑫r間對大鼠大腦皮層鈣通道電流曲線的影響

Figure 4.Influence of different time of MCAO on calcium channel of cerebral cortex in DM rats.A:Ca2+channel current curves during different time of MCAO in DM rats;B:I/V curves.圖4 糖尿病大鼠局灶性腦缺血不同時間對大鼠大腦皮層鈣通道電流曲線的影響

討 論

細(xì)胞膜上分布著多種離子通道，感知細(xì)胞內(nèi)外的各種變化，使通道處于開放/失活狀態(tài)。L－型電壓門控鈣通道(L －type voltage－gated calcium channels，L－VGCCs)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過細(xì)胞膜上動作電位與梯度電位的變化調(diào)節(jié)鈣通道，使胞外的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行神經(jīng)元之間信息交流，因此被認(rèn)為是介導(dǎo)神經(jīng)元鈣內(nèi)流的主要途徑[8]。正常情況下內(nèi)流的鈣參與多種細(xì)胞功能調(diào)控，而L－VGCCs的過度開放可以引起細(xì)胞內(nèi)的鈣超載，觸發(fā)Ca2+依賴的級聯(lián)反應(yīng)[9]，加重細(xì)胞損傷。

本研究應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄了單純局灶腦缺血不同時間缺血周邊皮層神經(jīng)元鈣通道電流的變化，結(jié)果顯示單純局灶腦缺血各組中隨著缺血時間的延長，L型電壓門控鈣離子通道的Ca2+電流逐漸增大，Ca2+電流I－V曲線明顯下移，各組間比較P＜0.05，Ca2+電流的增大加重了細(xì)胞內(nèi)的鈣內(nèi)流，引起細(xì)胞損傷，這與文獻(xiàn)報道相一致[10]，再次證明了L－VGCCs的過度開放參與了腦缺血損傷。

應(yīng)用同樣方法，我們記錄了糖尿病大鼠局灶腦缺血不同時間缺血周邊皮層神經(jīng)元鈣通道電流的變化，結(jié)果顯示糖尿病腦缺血各組中隨著缺血時間的延長，L型電壓門控鈣離子通道的Ca2+電流逐漸增大，Ca2+電流I－V曲線明顯下移，各組間比較P＜0.05，與單純局灶腦缺血各組相比，糖尿病腦缺血各組Ca2+電流逐漸增大，相同時點2組間比較P＜0.05，說明糖尿病腦缺血時L－VGCCs通道開放明顯高于單純?nèi)毖M，且與缺血時間長短呈正相關(guān)。

Wang等[11]的一項關(guān)于缺氧條件下肺動脈細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)ROS增加可以抑制電壓依賴鉀通道、增加鈣通道的活性;Amberg等[12]一項最新研究表明自由基的增加導(dǎo)致了蛋白激酶C活性的增強(qiáng)，使局部的L－VGCCs激活，增加鈣內(nèi)流，說明氧化應(yīng)激損傷促進(jìn)了L－VGCCs的開放。我們前期工作中證實在糖尿病局灶腦缺血時AGEs、RAGE表達(dá)增加[13]，而AGEs增加的結(jié)果則使自由基生成增多[14]。因此，我們可以得出如下結(jié)論:糖尿病腦缺血時L－VGCCs過度開放、Ca2+電流增大引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載加重，這可能是糖尿病腦缺血損傷加重的機(jī)制之一，原因與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，然而氧化應(yīng)激如何參與L－VGCCs過度開放則需在以后的研究中進(jìn)一步明確。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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