陳兆波， 劉春艷， 倪娜娜， 于 洋， 張鵬舉， 陳蔚文， 崔福愛， 姜安麗

(山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，山東濟南250012)

NKX3.1是前列腺特異性和雄激素調(diào)控的同源框基因[1]，它與前列腺的發(fā)育、成熟[2，3]及前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。NKX3.1基因位于染色體8p21區(qū)域[5]，基因全長約 4 223 bp，具有 2 個外顯子，1個內(nèi)含子，編碼234個氨基酸，其表達產(chǎn)物屬于核轉(zhuǎn)錄因子。大約80%的前列腺癌細(xì)胞會雜合缺失該區(qū)域[6，7]，它的表達缺失與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而且決定了腫瘤發(fā)生的組織特異性，這表明NKX3.1可能是一種潛在的抑癌基因[8]。研究認(rèn)為NKX3.1蛋白可能是通過激活caspase凋亡途徑，及誘導(dǎo)凋亡抑制基因bcl－2的表達，起到誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用[9]，但NKX3.1在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的確切作用機制仍不清楚。本實驗將NKX3.1真核表達載體pcDNA3.1－NKX3.1轉(zhuǎn)染前列腺癌PC－3細(xì)胞，研究NKX3.1對抗凋亡基因bcl－2表達的影響及對前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用，為進一步研究NKX3.1在前列腺腫瘤中的作用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 主要材料

pcDNA3.1載體、Trizol試劑和質(zhì)粒抽提試劑盒購于Invitrogen;Taq酶和PCR試劑盒購于大連寶生物工程公司;M－MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶和快速凝膠回收試劑盒購于Fermentas;大腸桿菌JM109由本室保存;NKX3.1真核表達載體pcDNA3.1－NKX3.1由本課題組克隆構(gòu)建[9];前列腺癌PC－3細(xì)胞株購于中科院上海細(xì)胞所;鼠抗人Bcl－2購于Santa Cruz，羊抗鼠IgG購于北京中衫金橋;RPMI－1640培養(yǎng)基購于HyClone;胎牛血清購于四季青公司;其余為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 前列腺癌PC－3細(xì)胞生長于含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及1×105U/L鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 前列腺癌PC－3細(xì)胞以5×108/L接種于50 mL培養(yǎng)瓶中。當(dāng)細(xì)胞融合度＞90%時，按照FuGENE? HD轉(zhuǎn)染試劑說明將pcDNA3.1－NKX3.1載體轉(zhuǎn)染 PC －3細(xì)胞(PC3－NKX3.1+)，對照組將相同劑量pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染PC－3細(xì)胞(PC3 －NKX3.1－)，每瓶以 16 μL FuGENE? HD 轉(zhuǎn)染試劑+8 μg質(zhì)粒DNA+4 mL 10%胎牛血清RPMI－1640培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染。

2.3 RT－PCR檢測bcl－2 mRNA的表達 前列腺癌PC－3細(xì)胞在轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1－NKX3.1載體或pcDNA3.1空載體48 h后，用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，使用隨機六聚體引物和M－MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶將細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增bcl－2 mRNA片段(304 bp)。PCR引物正義鏈5’－GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA －3’，反義鏈5’－AGGCACCCAGGGTGATGCAA－3’。內(nèi)參照 β－actin正義鏈5’－GTGGGGCGCCCCAGGCACCA－3’，反義鏈 5’－CTCCTTAATGTCACGCACGATTT－3’，擴增β－actin片段550 bp。PCR反應(yīng)條件相同，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

2.4 Western blotting檢測Bcl－2蛋白表達 前列腺癌PC－3細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－NKX3.1載體或pcDNA3.1空載體48 h后，用細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris－ HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.1%SDS，1%NP－40，1×蛋白酶抑制劑)收集細(xì)胞總蛋白。BCA法定量后，Ⅰ抗為1∶200稀釋的鼠抗Bcl－2，Ⅱ抗為1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG。以β－actin為內(nèi)參照，加入ECL顯色劑顯色，暗室中曝光X光片觀察。

2.5 EMSA檢測 NKX3.1與bcl－2基因上游調(diào)控區(qū)中的NKX3.1結(jié)合元件相互作用 前列腺癌PC－3細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－NKX3.1載體或空載體48 h后，收集細(xì)胞，制備細(xì)胞核蛋白。通過分析軟件MatInspector 2.2檢測在 bcl－2基因啟動子上游－1 146 bp至－1 153 bp處有一個NKX3.1結(jié)合元件序列(nucleotide－binding site，NBS)，人工合成雙拷貝NBS及互補鏈，NBS正義鏈為ATACCAAGTATTTATACCAAGTATTT(雙拷貝)。以TEN緩沖液(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L NaCl，pH8.0)分別溶解NBS單鏈，等摩爾比混合2條單鏈，加熱退火生成雙鏈NBS，按Roche提供的DIG Gel Shift Kit說明，用末端轉(zhuǎn)移酶對其進行末端地高辛標(biāo)記，作為EMSA檢測中的探針。設(shè)置6個反應(yīng)管:(1)標(biāo)記探針不加核蛋白;(2)標(biāo)記探針加核蛋白;(3)標(biāo)記探針加核蛋白及125倍過量的未標(biāo)記的同源探針;(4)標(biāo)記探針加核蛋白及125倍過量的未標(biāo)記的異源探針;(5)標(biāo)記探針加核蛋白及NKX3.1抗體;(6)標(biāo)記探針加轉(zhuǎn)染空載體的PC－3核蛋白(作為陰性對照)。室溫反應(yīng)20 min，然后進行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移凝膠條帶至陽離子尼龍膜，加地高辛抗體及顯影底物CSPD，曝光X光膠片，觀察電泳遷移率的改變。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 前列腺癌PC－3細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－NKX3.1載體或pcDNA3.1空載體48 h后，用胰酶消化收集細(xì)胞，70%預(yù)冷乙醇固定，4℃冰箱放置12 h以上，按照Sub－G1法以流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞并分析細(xì)胞的周期分布。

2.7 Hoechst 33258染色檢測細(xì)胞凋亡 前列腺癌PC－3細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－NKX3.1載體或pcDNA3.1空載體48 h后，使用Hoechst 33258凋亡檢測試劑盒染色，紫外燈下激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，熒光成像系統(tǒng)采集圖像。

結(jié) 果

1 NKX3.1下調(diào)bcl－2 mRNA的表達

結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1載體對照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－NKX3.1載體的PC－3細(xì)胞中 bcl－2 mRNA的表達明顯下降，見圖1。

Figure 1.The effects of NKX3.1 on the expression of bcl－ 2 mRNA in PC －3 cells.M:marker;1:PC －3(NKX3.1－);2:PC－3(NKX3.1+).±s.n=3.*P ＜0.05 vs PC －3(NKX3.1－).圖1 NKX3.1對PC－3細(xì)胞中Bcl－2 mRNA表達的影響

2 NKX3.1下調(diào)Bcl－2蛋白的表達

結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1載體對照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－NKX3.1載體的PC－3細(xì)胞中Bcl－2蛋白的表達明顯下降，見圖2。

Figure 2.The effects of NKX3.1 on the expression of Bcl－ 2 protein in PC －3 cells.1:PC －3(NKX3.1－);2:PC－3(NKX3.1+).±s.n=3.*P＜0.05 vs PC－3(NKX3.1－).圖2 NKX3.1對PC－3細(xì)胞中Bcl－2蛋白表達的影響

3 NKX3.1與bcl－2基因上游調(diào)控區(qū)中的NKX3.1結(jié)合元件相互作用

圖3顯示，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1－NKX3.1的 PC －3細(xì)胞核提取液中具有與NBS結(jié)合的蛋白(3泳道)，此結(jié)合可被同源序列競爭抑制 (4泳道)，而不被異源序列競爭抑制(5泳道)，并可被特異的NKX3.1抗體阻斷(6泳道)。PC－3細(xì)胞不表達NKX3.1蛋白，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的PC－3核蛋白中沒有與NBS的結(jié)合蛋白帶(2泳道)。說明NKX3.1可與bcl－2基因上游調(diào)控區(qū)中的NKX3.1結(jié)合元件特異結(jié)合，調(diào)節(jié)bcl－2基因的表達。

Figure 3.The interaction of NKX3.1 with NKX3.1 －binding element in upstream of bcl－2 gene detected by EMSA.1:NBS probe;2:NBS probe+nucleoprotein of PC3－ NKX3.1－;3:NBS probe+nucleoprotein of PC3－ NKX3.1+;4:NBS probe+nucleoprotein of PC3－NKX3.1++125 － fold excess NBS unlabled;5:NBS probe+nucleoprotein of PC3 － NKX3.1++125－fold excess ARE unlabled;6:NBS probe+nucleoprotein of PC3 － NKX3.1++NKX3.1 antibody.圖3 EMSA檢測NKX3.1與bcl－2基因上游調(diào)控區(qū)中的NKX3.1結(jié)合元件相互作用

4 NKX3.1誘導(dǎo)PC－3細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示，NKX3.1可使PC－3細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加，細(xì)胞凋亡數(shù)由7.00%增加至16.88%，見圖4。

Figure 4.NKX3.1－induced apoptosis of PC －3 cells detected by flow cytometer.PC3 － NKX3.1+:PC － 3 cells transfected with pcDNA3.1 － NKX3.1 vector;PC3 －NKX3.1－:PC － 3 cells transfected with pcDNA3.1 vector.圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測NKX3.1對PC－3細(xì)胞凋亡的影響

PC－3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，同時使用Hoechest 33258凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡?？砂l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－NKX3.1載體后，細(xì)胞凋亡小體數(shù)量明顯增加，見圖5。

Figure 5.NKX3.1－induced apoptosis of PC －3 cells detected by Hoechst 33258 staining(×100).PC3－NKX3.1+:PC －3 cells transfected with pcDNA3.1 － NKX3.1 vector;PC3 － NKX3.1 －:PC －3 cells transfected with pcDNA3.1 vector.圖5 Hoechst 33258染色檢測NKX3.1對PC－3細(xì)胞凋亡的影響

討 論

NKX3.1是前列腺特異性表達的同源盒基因，受雄性激素調(diào)節(jié)，其產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)與功能上屬于核轉(zhuǎn)錄因子[10]，發(fā)揮抑制前列腺上皮增生及維持分化的作用。有關(guān)NKX3.1蛋白功能的研究較少，其在前列腺癌發(fā)育和發(fā)生過程中的作用及機制并不是十分清楚。本實驗選用的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C－3細(xì)胞是一種雄性激素非依賴性生長并且NKX3.1基因缺陷的細(xì)胞株，通過瞬時轉(zhuǎn)染NKX3.1真核表達載體pcDNA3.1－NKX3.1，使 NKX3.1 在 PC －3 細(xì)胞中重新表達，在此基礎(chǔ)上研究NKX3.1在前列腺癌中的作用，并通過流式細(xì)胞術(shù)和凋亡小體染色檢測方法證明NKX3.1可促進細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞的凋亡受多種基因的影響，是一個涉及多基因、多分子水平變化的多階段過程，在其過程中不同功能的基因和分子對細(xì)胞所產(chǎn)生的影響協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。眾多研究表明bcl－2基因是抗細(xì)胞凋亡的重要基因[11，12]，與腫瘤耐藥和放療耐受關(guān)系密切，其過度表達可抑制細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞增殖與程序性細(xì)胞死亡失衡[13，14]。Hockenbery 等[12]認(rèn)為 bcl－2基因家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用具重要意義，而且近年研究也發(fā)現(xiàn)bcl－2在腫瘤中高表達可以使腫瘤的耐藥性增加，增強的bcl－2表達在前列腺癌扮演重要角色。研究表明[15]，在 NKX3.1與 p27KIP1缺失的前列腺癌細(xì)胞中恢復(fù)這2個基因的表達時，可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡;實驗更進一步發(fā)現(xiàn)NKX3.1與p27KIP1這2個基因的協(xié)同作用可以降低抗細(xì)胞凋亡基因bcl－2以及下游產(chǎn)物bax的表達。但是，目前NKX3.1是否可以直接影響bcl－2基因的表達尚未見文獻報道。

本研究中，在瞬時轉(zhuǎn)染NKX3.1表達載體后，通過RT－PCR和 Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，bcl－2 mRNA和Bcl－2蛋白的表達水平明顯下降。通過分析軟件MatInspector2.2檢測在bcl－2基因上游有一個NKX3.1結(jié)合元件序列(NBS)，人工合成NBS通過EMSA檢測NKX3.1與bcl－2基因上游調(diào)控區(qū)中的NKX3.1結(jié)合元件相互作用。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－NKX3.1的PC－3細(xì)胞核提取液中具有與NBS結(jié)合的核蛋白，并通過競爭結(jié)合實驗及特異抗體阻斷實驗證明此結(jié)合是特異性的，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的PC－3核蛋白中沒有與NBS的結(jié)合蛋白帶。說明NKX3.1與bcl－2基因上游調(diào)控區(qū)中的NKX3.1結(jié)合元件特異結(jié)合，可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)bcl－2基因的表達。

我們的實驗結(jié)果表明NKX3.1可在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)抗凋亡基因bcl－2的表達，促進前列腺癌細(xì)胞凋亡。此結(jié)果為進一步研究NKX3.1促進細(xì)胞凋亡機制及其在前列腺癌中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[1]Trachtenberg J，Blackledge G.Looking to the future:advances in the management of hormone－refractory prostate cancer[J].Eur Urol Supp1，2002，1(7):44 －53.

[2]Sciavolino PJ，Abrams EW，Yang L，et al.Tissue－specific expression of murine Nkx3.1 in the male urogenital system[J].Dev Dyn，1997，209(1):127－138.

[3]Bieberich CJ，F(xiàn)ujita K，He WW，et al.Prostate－specific and androgen－dependent expression of a novel homeobox gene[J].J Biol Chem，1996，271(50):31779 －31782.

[4]Bhatia － Gaur R，Donjacour AA，Sciavolino PJ，et al.Roles for Nkx3.1 in prostate development and cancer[J].Genes Dev，1999，13(8):966－977.

[5]He WW，Sciavolino PJ，Wing J，et al.A novel human prostate－specific，androgen－regulated homeobox gene(NKX3.1)that maps to 8p21，a region frequently deletion in prostate cancer[J].Genomics，1997，43(1):69－77.

[6]Vocke CD，Pozzatti RO，Bostwick DG，et al.Analysis of 99 microdissected prostate arcinomas reveals a high frequency of allelic loss on chromosome 8p12 － 21[J].Cancer Res，1996，56(10):2411 －2416.

[7]Ornstein DK，Cinquanta M，Weiler S，et al.Expression studies and mutational analysis of the androgen regulated homeobox gene NKX3.1 in benign and malignant prostate epithelium[J].J Urol，2001，165(4):1329 －1334.

[8]Korkmaz KS，Korkmaz CG，Ragnhildstveit E，et al.Full－length cDNA sequence and genomic organization of human NKXA－alternative forms and regulat ion by both androgens and estrogen[J].Gene，2000，260(1 －2):25－36.

[9]劉聞聞，于春曉，崔福愛，等.人同源盒基因Nkx3.1對前列腺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2006，22(12):996 －1002.

[10]Holmes KA，Song JS，Liu XS，et al.Nkx3－1 and LEF－1 function as transcriptional inhibitors of estrogen receptor activity[J].Cancer Res，2008，68(18):7380 －7385.

[11]Williams GT.Programmed cell death:apoptosis and oncogenesis[J].Cell，1991，65(7):1097 －1098.

[12]Hockenbery D，Nunez G，Milliman C，et al.Bcl－2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death[J].Nature，1990，348(6299):334－336.

[13]Green DR，Reed JC.Mitochondria and apoptosis[J].Science，1998，281(5381):1309－1312.

[14]Frei H.Cancer medicine[M].5th ed.Singapore:Harcourt Asia Pte Ltd，2001.24 －28.

[15]Wang P，Ma Q，Luo J，et al.Nkx3.1 and p27KIP1cooperate in proliferation inhibition and apoptosis induction in human androgen － independent prostate cancer cells[J].Cancer Invest，2009，27(4):369－375.