朱 嫦， 楊雅瑩， 易永芬

(重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室，分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶400016)

胃癌是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，高居癌癥死因的第2位[1]。探討胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制并對其進行有效防治是長期以來的研究熱點。細胞表面糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)尤其是N－聚糖的改變與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[2－4]。高爾基體α－甘露糖苷酶Ⅱ(Golgi mannosidaseⅡ，GMⅡ)是N－聚糖形成中的關(guān)鍵性糖苷酶之一，其被特異性抑制后腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移明顯降低，因此GMⅡ可能成為抗癌治療的重要靶點[5－7]。GMⅡ在胃癌中的作用和意義國內(nèi)外文獻均少見報道，本研究通過RT－PCR、免疫組織化學(xué)和Western blotting等方法分別檢測GMⅡ基因和蛋白在不同分化胃癌細胞系和組織中的表達，初步探討GMⅡ與胃癌的關(guān)系，為進一步研究GMⅡ在胃癌發(fā)生和發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 RPMI－1640培養(yǎng)基干粉、DEPC水和DMSO購自Sigma。小牛血清、胰蛋白酶購自Hy-Clone。SP免疫組化試劑盒及DAB染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。Trizol購自Invitrogen。RT－PCR試劑盒和DNA marker購自寶生物工程大連有限公司。蛋白裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒和蛋白marker購自碧云天生物技術(shù)公司。PVDF膜購自Millipore。MAN2A1(人GMⅡ基因)羊抗人多克隆抗體購自Santa Cruz。化學(xué)發(fā)光試劑盒購自天根生物技術(shù)有限公司。兔抗人β－actin多抗、HRP標(biāo)記兔抗羊IgG和HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2 組織和細胞來源 收集2008年10月－2010年10月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，所有病例術(shù)前均未接受放化療。其中癌組織38例，正常癌旁胃黏膜組織30例(癌旁5cm以上)。其中高分化胃癌8例、中分化胃癌18例和低分化胃癌12例。手術(shù)標(biāo)本取材后立即放入液氮罐保存，組織標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，每例蠟塊4 μm厚連續(xù)切片做免疫組化，所有病例均經(jīng)過病理學(xué)診斷證實。永生化的人胃黏膜上皮細胞系(GES－1)購自第四軍醫(yī)大學(xué)細胞庫，高分化(MKN－28)、中分化(SGC－7901)和低分化(BGC－823)胃癌細胞系均為重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心凍存。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及爬片制備 以上4種細胞均接種在含10%小牛血清、1×105U/L青霉素、1×105U/L鏈霉素的 RPMI－1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，待細胞長到90%時進行傳代培養(yǎng)，將對數(shù)生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化，加含10%小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液終止消化，接種于6孔板中(內(nèi)置無菌載玻片)，待細胞長至80%時后吸出培養(yǎng)液，加4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2遍后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 免疫組化檢測GMⅡ蛋白的表達 組織石蠟切片:常規(guī)脫蠟至水，用3%H2O2作用10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶干擾，枸櫞酸鈉緩沖液15 min抗原修復(fù)，PBS洗后血清封閉30 min，滴加1∶50 GMⅡ多克隆抗體4℃孵育過夜，PBS清洗5 min×3次后加生物素化的 II抗，抗37℃孵育30 min，PBS清洗5 min×3次后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片，PBS代替I抗做陰性對照，每張切片至少觀察5個隨機高倍視野，按照陽性細胞所占比例記分:≤5% 為0分;6% －24%為1分;25% －50%為2分;＞50%為3分。同時根據(jù)染色強度記分為:無著色為0分;淡黃色為1分;黃色或深黃色為2分;褐色或深褐色為3分。兩項指標(biāo)的積分相加結(jié)果:≤1分為陰性，＞1為陽性。細胞爬片:除無抗原修復(fù)外處理方法同石蠟切片，拍片后采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算視野累積吸光度值(IA)，以吸光度值代表GMⅡ的相對含量。

2.3 RT－PCR檢測GMⅡmRNA的表達 按Trizol試劑盒說明提取各組組織和細胞的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀測定RNA的質(zhì)量、濃度及純度。按RT－PCR試劑盒說明合成cDNA第1鏈GMⅡ引物序列如下:上游引物 5'－GTTTATTGTCGAAAGTCTCACACC －3'，下游引物 5'－ CACCTCAACTGGATTCGG －3'，擴增產(chǎn)物長度為126 bp;βactin上游引物5'－GCACCCAGCACAATGAAG －3'，下游引物 5'－GCCAATCTCATCTTGTTTTC －3'，擴增產(chǎn)物長度為356 bp，引物由上海生工合成。PCR反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性 2 min，94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)，72℃ 10 min。結(jié)束后取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。采用Quantity One軟件分析電泳條帶的灰度值，以βactin為內(nèi)參照，以各條帶與內(nèi)參照的灰度值的比值表示GMⅡmRNA的相對含量。

2.4 Western blotting檢測GMⅡ蛋白的表達 提取各組組織和細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，樣品和上樣緩沖液以4∶1混合變性，SDS－PAGE電泳后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h，加入GMⅡ抗體(1∶300)和 β －actin抗體(1∶400)，4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記 II抗(1∶1 000)孵育1 h，TBST洗脫3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，采用Quantity One軟件測定條帶的吸光度值，以β－actin為內(nèi)參照，以各條帶與內(nèi)參照的吸光度的比值表示GMⅡ蛋白的相對含量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 免疫組化檢測GMⅡ蛋白在胃癌組織中的表達

GMⅡ陽性染色位于胞漿，為均勻一致的棕黃色顆粒。30例正常胃組織中陽性染色為53%(16/30)，8例高分化胃癌組織中的陽性染色為63%(5/8)，18例中分化胃癌組織的陽性染色為83%(15/18)，12例低分化胃癌組織的陽性染色為100%(12/12)，各組之間比較差異顯著(P＜0.05)，見表1、圖1。

表1 高、中、低分化胃癌組和正常胃黏膜組織組中GMⅡ的表達情況Table 1.The expression of GMⅡin well－differentiated，moderately differentiated and poorly－differentiated gastric cancer tissues and normal gastric tissues

2 免疫組化檢測GMⅡ蛋白在胃癌細胞系中的表達

正常胃黏膜上皮細胞系GES－1和3種胃癌細胞系MKN－28、SGC －7901、BGC－823染色平均吸光度分別為0.18±0.02、0.21±0.01、0.27±0.04、0.29±0.06，各組間差異顯著(P＜0.05，n=3)。GMⅡ在低分化胃癌細胞系BGC－823中表達最高;而在正常胃黏膜上皮細胞系GES－1中表達最低，見圖2。

3 RT－PCR檢測GMⅡmRNA在胃癌細胞系中的表達

Figure 1.The positive expression of GMⅡ protein by immunohistochemistry in four gastric tissues(SP，×400).A:human normal gastric tissues;B:well－differentiated gastric cancer tissues;C:moderately－differentiated gastric cancer tissues;D:poorly－differentiated gastric cancer tissues.圖1 免疫組化檢測GMⅡ在胃組織中的陽性表達

Figure 2.The positive expression of GMⅡ protein detected by immunohistochemistry in four gastric cell lines(SP，×400).A:GES－1;B:MKN－28;C:SGC－7901;D:BGC －823.圖2 免疫組化檢測GMⅡ在4種細胞系中的陽性表達

GMⅡmRNA在正常胃黏膜上皮細胞系GES－1與3種不同分化的胃癌細胞系中均呈陽性表達。與GES－1相比，3種胃癌細胞系MKN－28、SGC－7901和BGC－823中GMⅡmRNA的表達水平顯著增加，并且在低分化胃癌細胞系BGC－823中表達最高;而在高分化胃癌細胞系MKN－28中表達最低。各組之間比較差異顯著(P＜0.05)，見圖3。

4 RT－PCR檢測GMⅡmRNA在胃癌組織中的表達

Figure 3.Expression of GMⅡ mRNA detected by RT－PCR infour gastric cell lines.M:DNA marker;Lane 1:GES－1;Lane 2:MKN－28;Lane 3:SGC－7901;Lane 4:BGC－823.±s.n=3.*P＜0.05 vs GES－1.#P＜0.05 vs SGC－7901;△P＜0.05 vs BGC－823.圖3 RT－PCR檢測4種胃細胞系中GMⅡmRNA的表達水平

GMⅡmRNA在30例正常胃黏膜組織、8例高分化胃癌組織、18例中分化胃癌組織和12例低分化胃癌組織中相對含量分別為0.25±0.13、0.40±0.27、0.58±0.56和0.74±0.23。GMⅡmRNA在正常胃黏膜組織中GMⅡ表達最低，低分化胃癌組織中表達最高，各組間比較差異顯著(P＜0.05)，見圖4。

5 Western blotting檢測GMⅡ蛋白在胃癌細胞系中的表達

內(nèi)參照β－actin位于42 kD位置，條帶粗細亮度基本一致，沒有顯著差異，4種細胞系在132kD處均出現(xiàn)GMⅡ的陽性表達，與β－actin蛋白的灰度比值顯示GMⅡ蛋白在GES－1中的表達量最低，在MKN－28、SGC－7901和BGC－823 3組不同分化的胃癌細胞系中表達逐漸增加，分化越差，GMⅡ蛋白的表達越高。各組之間比較差異顯著(P＜0.05)，見圖5。

6 Western Blotting檢測GMⅡ蛋白在胃癌組織中的表達

Figure 4.Expression of GMⅡmRNA detected by RT－PCR in four gastric cell tissues.M:DNA marker;Lane 1:human normal gastric tissues;Lane 2:well－differentiated gastric cancer tissues;Lane 3:moderately－differentiated gastric cancer tissues;Lane 4:poorly－differentiated gastric cancer tissues.±s.n=3.*P＜0.05 vs group 1.#P ＜0.05 vs group 3;△P ＜0.05 vs group 4.圖4 RT－PCR檢測4種胃組織中GMⅡ的基因表達水平

Figure 5.Expression of GMⅡ protein detected by Western blotting in four gastric cell lines.Lane 1:GES－1;Lane 2:MKN－28;Lane 3:SGC－7901:Lane 4:BGC－823.±s.n=3.*P＜0.05 vs GES－1.圖5 Western blotting檢測4種胃細胞系中GMII蛋白的表達水平

GMⅡ蛋白在30例正常胃黏膜組織、8例高分化胃癌組織、18例中分化胃癌組織、12例低分化胃癌組織中相對含量分別為0.12±0.03、0.33±0.24、0.49±0.17和0.62±0.51，GMⅡ在正常胃黏膜組織中表達最低，在中、低分化胃癌組織中表達最高，高分化胃癌組織中表達居中。各組之間比較差異顯著(P ＜0.05)，見圖6。

Figure 6.Expression of GMⅡ protein detected by Western Blotting in four gastric cell tissues.Lane 1:human normal gastric tissues;Lane 2:well－differentiated gastric cancer tissues;Lane 3:moderately－differentiated gastric cancer tissues;Lane 4:poorly－differentiated gastric cancer tissues.圖6 Western blotting檢測4種胃組織中GMⅡ的蛋白表達水平

討 論

惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移實質(zhì)上是細胞與其周圍環(huán)境(包括相鄰細胞、細胞外可溶性生物活性分子及不溶性細胞外基質(zhì))之間相互作用失常所致，而細胞表面正是介導(dǎo)了細胞與周圍環(huán)境的相互作用。細胞表面以糖蛋白分布最為廣泛，如信號分子的受體、細胞黏附分子等。糖蛋白借助其糖鏈所攜帶的多種多樣的生物識別信息，實現(xiàn)細胞與周圍環(huán)境的聯(lián)系，從而影響細胞的存活或凋亡、增殖與分化、遷移與侵襲等活動[8]。因此，細胞表面糖蛋白的的改變與腫瘤的生物學(xué)行為，如惡性轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移與侵襲等密切相關(guān)[9]。

糖蛋白是糖鏈通過N－糖基化和O－糖基化作用修飾蛋白質(zhì)而形成。α－甘露糖苷酶是蛋白質(zhì)N－糖基化修飾中關(guān)鍵性糖苷酶，它通過剪切N－糖鏈甘露糖殘基而在聚糖從高甘露糖型轉(zhuǎn)化成復(fù)雜型結(jié)構(gòu)中起著重要的作用。迄今為止，已克隆的α－甘露糖苷酶cDNA有20多種，其中來自人類的有6種。高爾基體α－甘露糖苷酶Ⅱ(GMⅡ)在哺乳動物組織中分布廣泛，它位于高爾基體的反面和中間體，分子量約為132 kD，其cDNA與鼠科動物的相近，位于5號染色體。GMⅡ分 子中含有糖基水解酶家族38(glycosyl hydrolase family 38)的保守序列，因此能特異性地剪切GlcNAc2Man5GlcNAc上 α －1，3和 α －1，6連接的甘露糖殘基，形成 Glc2Man3GlcNAc[10]。

研究表明，GMⅡ與多種類型腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān)。在乳腺、結(jié)腸及皮膚癌中，GMⅡ所引起的細胞表面復(fù)合糖數(shù)量分布的異常促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其臨床預(yù)后更差。GMⅡ被苦馬豆堿(swainsonine，SW)特異性抑制后，細胞表面的N－聚糖發(fā)生改變，肝癌細胞的黏附和遷移行為被明顯抑制;正常尿路上皮及膀胱癌細胞GMⅡ被SW抑制后，其與纖維連接蛋白及IV型膠原纖維結(jié)合能力分別增加1.5及2倍，同時膀胱癌細胞的遷移率下降20%;在惡性黑色素瘤和淋巴瘤中也有類似的研究發(fā)現(xiàn)[11，12]。GMⅡ促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的確切機制目前并不清楚。有研究者認為，GMⅡ可能通過對糖蛋白分子的質(zhì)量控制、成熟、運輸以及分泌來調(diào)控細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)之間的識別[13]。GMⅡ抑制后腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附降低、對LAK和NK細胞的殺傷敏感性增強、細胞表面整合素糖蛋白分子中的寡糖基與其它細胞的配體結(jié)合受阻或者通過細胞表面凝集素介導(dǎo)的凋亡等均提示GMⅡ可能成為抗癌治療的重要靶點[11，12]。

GMⅡ蛋白在胃癌中作用目前研究較少，國內(nèi)研究者[13]曾用SW處理的胃癌細胞接種至裸鼠，結(jié)果顯示裸鼠體內(nèi)成瘤能力及轉(zhuǎn)移能力均降低，這提示GMⅡ在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。但是，SW對GMⅡ抑制的非特異性(SW同時抑制細胞漿、溶酶體α－甘露糖苷酶)[6]以及體內(nèi)實驗中SW抗癌作用的發(fā)揮可能是通過免疫調(diào)節(jié)機制而非抑制GMⅡ，使得GMⅡ在胃癌發(fā)生和發(fā)展中的具體作用有待更加深入的研究。在癌變過程中，為糖鏈合成酶編碼的基因表達異?；虬l(fā)生突變或活性異常是導(dǎo)致糖鏈結(jié)構(gòu)形成發(fā)生異常的重要原因。GMⅡ基因及其蛋白在胃癌中的表達情況國內(nèi)外文獻均鮮見報道。前期實驗中我們已應(yīng)用免疫組化法研究分析了GMⅡ與臨床病理特征之間的關(guān)系，表明GMⅡ在胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲遷移中可能扮演著重要的角色[14]。本研究進一步通過RT－PCR、免疫組化法和Western blotting等方法分別檢測GMⅡ基因和蛋白在3種不同分化胃癌細胞系及胃癌組織中的差異表達。結(jié)果顯示，與正常胃黏膜上皮相比，3種胃癌細胞系MKN－28、SGC－7901、BGC－823中GMⅡ的基因及蛋白表達水平顯著增加。并且，GMⅡ在低分化胃癌細胞系BGC－823中表達最高;而在高分化胃癌細胞系MKN－28中表達最低。此外，本研究還應(yīng)用同樣方法對不同分化的臨床組織標(biāo)本進行進一步研究，結(jié)果顯示，GMⅡ表達水平在正常胃組織中最低，在低分化胃癌組織中表達最高，結(jié)果與對細胞系的研究結(jié)果一致。這進一步提示GMⅡ參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展，GMⅡ蛋白表達與胃癌的分化程度相關(guān);而胃癌組織中GMⅡ基因表達的增高，為以GMⅡ為靶點的基因治療提供重要的理論基礎(chǔ)。

[1]蔣 振，郭俊明，肖丙秀，等.特異性微小RNA抑制劑對胃癌細胞增殖的影響[J].中國病理生理雜志，2009，25(9):1726 －1730.

[2]Pinho SS，Osório H，Nita－ Lazar M，et al.Role of E －cadherin N－glycosylation profile in a mammary tumor model[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，379(4):1091－1096.

[3]Santos IC，Silbiger VN，Higuchi DA，et al.Angiostatic activity of human plasminogen fragments is highly dependent on glycosylation[J].Cancer Sci，2010，101(2):453－459.

[4]Kariya Y，Kawamura C，Tabei T，et al.Bisecting GlcNAc residues on laminin－332 downregulates galectin－3 dependent keratinocyte motility[J].J Biol Chem，2010，285(5):3330－3340.

[5]van den Elsen JM，Kuntz DA，Rose DR.Structure of Golgi alpha－mannosidase II:a target for inhibition of growth and metastasis of cancer cells[J].EMBO J，2001，20(12):3008－3017.

[6]Fiaux H，Kuntz DA，Hoffman D，et al.Functionalized pyrrolidine inhibitors of human type II α－mannosidases as anti－cancer agents:optimizing the fit to the active site[J].Bioorg Med Chem，2008，16(15):7337 －7346.

[7]Gerber－Lemaire S，Juillerat－Jeanneret L.Glycosylation pathways as drug targets for cancer:glycosidase inhibitors[J].Mini Rev Med Chem，2006，6(9):1043 －1052.

[8]Lau KS，Partridge EA，Grigorian A，et al.Complex N －glycan number and degree of branching cooperate to regulate cell proliferation and differentiation[J].Cell，2007 ，129(1):123－134.

[9]Varki A，Kannagi R，Toole BP.Glycosylation changes in cancer[A].In:Varki A，Cummings RD，Esko JD，et al.eds.Essentials of glycobiology[M].2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009.537 －551.

[10]Suits MD，Zhu Y，Taylor EJ，et al.Structure and kinetic investigation of Streptococcus pyogenes family GH38 αmannosidase[J].PLoS One，2010，5(2):e9006.

[11]Suzuki O，Abe M.Cell surface N －glycosylation and sialylation regulate galectin－3－induced apoptosis in human diffuse large B cell lymphoma[J].Oncol Rep，2008，19(3):743－748.

[12]Unverzagt C，Gundel G，Eller S，et al.Synthesis of multiantennary complex type N－glycans by use of modular building blocks[J].Chemistry，2009，15(45):12292 －12302.

[13]Liu B，Lin Y，Yin H.Inhibition effect of Swainsonine on the growth and metastasis of gastric cancer in vivo[J].Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，1998，20(3):168 －170.

[14]楊雅瑩，李艷青，易永芬，等.高爾基體α－甘露糖苷酶Ⅱ在胃癌中的表達及其與E－cadherin、Galectin－3的關(guān)系[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，35(9):1313－1316.