方勤 張亮 王思愚 區(qū)偉

肺癌是全世界癌癥死亡的常見病因之一，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占原發(fā)性肺癌的80%，而其中55%的患者在診斷時就已經(jīng)是局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。雖然以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療已經(jīng)提高了中位生存時間，但這部分患者的預(yù)后仍然很差，平均5年生存率不足5%[2]。近年來酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）分子靶向治療問世，使晚期NSCLC治療取得較大的突破，具有療效明顯、毒副作用小、耐受性好的優(yōu)勢，逐漸成為研究熱點(diǎn)之一[3-5]。

在探索哪些患者能獲益于TKI治療的過程中，研究者發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變是晚期NSCLC患者獲益于TKI治療的預(yù)測因子[6-10]。EGFR基因定位于人第7號染色體短臂，由118 kb組成，包括28個外顯子，其中第18-21號外顯子編碼TK區(qū)域。EGFR基因的眾多突變中，89%都位于第19、21號外顯子；這兩個位點(diǎn)突變已經(jīng)被證實(shí)與TKI治療有效有關(guān)[3]。數(shù)項前瞻性及回顧性研究[11-16]證實(shí)EGFR基因突變陽性的患者對TKI（吉非替尼或厄洛替尼）治療有效率為70%-80%，能有效延長無進(jìn)展生存時間（progressionfree survival, PFS）、提高生活質(zhì)量，其中位生存時間達(dá)20個月-30個月。

在局部或者晚期的NSCLC患者中，決定是否使用TKI治療時檢測EGFR基因突變的標(biāo)本多是選取原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶。在臨床工作中，由于穿刺活檢或經(jīng)支氣管鏡活檢獲取原發(fā)灶的組織量不夠，采用轉(zhuǎn)移灶特別是體表淋巴結(jié)作為EGFR突變狀況檢測較多。然而目前在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間EGFR基因突變狀況是否存在一致性尚不明確。Park[17]研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)腫瘤與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)之間，用直接測序法檢測EGFR基因突變狀況的不一致率為11.9%（12/101），而同時用異源雙鏈分析法檢測其不一致率為16.8%（17/101）。最近同類研究也顯示在NSCLC原發(fā)灶與相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶之間EGFR基因突變狀況的不一致率分別為27%（18/67）[18]、33%（16/45）[19]、28%（7/25）[20]。

本研究旨在通過比較NSCLC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間EGFR基因突變狀況，探索二者之間是否存在不一致性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 研究的入組標(biāo)準(zhǔn)如下：①完整切除原發(fā)病灶的NSCLC患者；②相應(yīng)的轉(zhuǎn)移病灶有足夠多的癌組織可行EGFR基因突變檢測；③既往未接受過TKI治療；④患者年齡＞18歲。2008年1月-2010年3月共收集了40對NSCLC原發(fā)灶及相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本，其中5對標(biāo)本因轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本量太少，無法行EGFR基因突變檢測而排除，最后共35對標(biāo)本入組。

記錄病例的臨床病理資料，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理分型、腫瘤分化情況、術(shù)后的病理分期等。術(shù)后的病理分期根據(jù)IASLC 2009年制定的NSCLC分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定[21]，腫瘤的分期與腫瘤發(fā)生時的診斷一致。腫瘤組織的病理分型根據(jù)2005年WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定[22]。吸煙史在患者第一次就診時獲得，吸煙狀態(tài)分為：①不吸煙者（一生中吸煙＜100支）；②曾經(jīng)吸煙者（術(shù)前12個月內(nèi)不再吸煙）；③現(xiàn)時吸煙者（術(shù)前12個月內(nèi)有吸煙并且≥100支）[9]。所有患者已經(jīng)被告知并同意使用其標(biāo)本用于分子和病理學(xué)分析。該試驗(yàn)已獲得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 本研究中所使用的EGFR基因檢測方法為TaqMan RT-PCR[23]。本次應(yīng)用的EGFR基因檢測試劑盒共檢測EGFR基因19號外顯子三種堿基缺失突變（A: Nucleotide 2240-2251del, Amino acid L747-A750del;B: Nucleotide 2235-2249del, Amino acid E746-A750del; C:Nucleotide 2240-2257del, Amino acid L747-S752del）及21號外顯子2種堿基置換突變（D: Nucleotide 2573 T＞G, Amino acid L858R; E: Nucleotide 2582 T＞A, Amino acid L861Q）共5個最常見突變位點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)大致過程如下：①兩位病理科醫(yī)生分別在顯微鏡下核對石蠟組織的HE染色玻片，選取腫瘤組織＞80%的石蠟塊；②切取每片10 μm厚的蠟片4張；③使用TIANamp基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN BIOTECH,北京) 從切片中提取出原發(fā)肺癌組織和轉(zhuǎn)移灶的基因組DNA；④進(jìn)行DNA提取物的驗(yàn)證：甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）管家基因（300 bp）PCR擴(kuò)增，GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈照射下進(jìn)行拍照（沒有PCR擴(kuò)增條帶的標(biāo)本需再次切片，再次提取DNA）；⑤把成功提取的DNA放入EP管中并分別加入EGFR基因檢測試劑盒（GP Medical Technologies, Beijing, China）中的正向引物、反向引物、探針等；⑥把標(biāo)本放入ABI7900 RT-PCR機(jī)（Esco Technologies, Inc., St. Louis, MO, USA）上進(jìn)行擴(kuò)增[24]；⑦應(yīng)用SDS 2.0軟件對擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析并判斷EGFR基因突變陰、陽性。

1.3 統(tǒng)計方法 統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件。計數(shù)資料分析采用Fisher's檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 患者的一般情況 35對NSCLC病例的配對標(biāo)本中，原發(fā)灶均是已經(jīng)完整切除的肺部病灶，35例配對的轉(zhuǎn)移灶中，29例是縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶（9枚隆突下淋巴結(jié)，8枚主動脈下淋巴結(jié)，8枚下氣管旁淋巴結(jié)，4枚上氣管旁淋巴結(jié)），4例是腦轉(zhuǎn)移病灶，2例是鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。所有病例在獲得腫瘤標(biāo)本前未曾接受過EGFR靶向治療。病例的一般情況數(shù)據(jù)如下：中位年齡為57歲（38歲-72歲）；女性14例（40%），男性21例（60%）；病理學(xué)類型為：鱗癌1例（2.9%），腺鱗癌3例（8.6%），腺癌31例（88.5%）；腫瘤分期：IIIa期24例（68.6%），IIIb期3例（8.6%），IV期8例（22.8%）；吸煙史：不吸煙者16例（45.8%），既往吸煙者13例（37.1%），現(xiàn)時吸煙者6例（17.1%）。

2.2 NSCLC原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移灶的EGFR基因突變狀況 EGFR基因突變RT-PCR擴(kuò)增曲線見圖1。在這項研究中，原發(fā)肺癌病灶中有29例（29/35, 82.86%）為EGFR基因突變型，余下6例為EGFR野生型。29例原發(fā)肺癌病灶EGFR突變類型分別為第19號外顯子突變15例、第21號外顯子突變14例。其中第19號外顯子突變中均為E746-A750缺失；第21號外顯子突變中13例為第858位密碼子堿基替換突變，1例為第861位密碼子堿基替換突變。

35例轉(zhuǎn)移灶中18例（18/35, 51.43%）為EGFR基因突變型，17例為EGFR野生型。18例EGFR基因突變型轉(zhuǎn)移灶的具體突變類型為：第19號外顯子突變11例、第21號外顯子突變7例。其中第19號外顯子突變中均為E746-A750缺失；第21號外顯子突變中均為第858位密碼子堿基替換突變（表1）。

2.3 原發(fā)NSCLC病灶和相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶的EGFR基因突變狀況比較 6例NSCLC原發(fā)灶為EGFR基因野生型的病例，其相應(yīng)的轉(zhuǎn)移灶分別為：3例腦轉(zhuǎn)移病灶、2例鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和1例上氣管旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，這6例轉(zhuǎn)移灶的EGFR基因均為野生型，與原發(fā)病灶一致。

29例原發(fā)灶EGFR基因突變型的病例中，只有18例EGFR基因突變，而其余11例轉(zhuǎn)移灶為EGFR基因野生型。18例EGFR突變型的轉(zhuǎn)移灶中，11例為第19號外顯子突變，病灶分別為：3例下氣管旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、3例隆突下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、3例主動脈下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及2例上氣管旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，第19號外顯子突變均為E746-A750缺失；另外7例為第21號外顯子突變，其相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶分別為：2例下氣管旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、2例隆突下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、2例主動脈下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及1例腦轉(zhuǎn)移灶，第21號外顯子突變均為第858位密碼子堿基替換突變。轉(zhuǎn)移灶的EGFR基因突變位點(diǎn)與原發(fā)病灶的突變位點(diǎn)一致。

11例（11/35, 31.43%, P=0.008）原發(fā)灶EGFR基因突變陽性而轉(zhuǎn)移灶為EGFR基因野生型的患者其轉(zhuǎn)移灶分別為：4例隆突下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、3例下氣管旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、3例主動脈下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。其原發(fā)灶EGFR基因突變類型為：第19號外顯子突變4例（均為E746-A750缺失）、第21號外顯子突變7例（6例為第858位密碼子堿基替換突變，1例為第861位密碼子堿基替換突變），其相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶均為EGFR基因野生型，與原發(fā)灶EGFR基因表達(dá)不一致。

圖 1 EGFR基因突變檢測RT-PCR擴(kuò)增曲線。A：19號外顯子E746-A750del；B：21號外顯子L858R E。Fig 1 RT-PCR amplification curve of EGFR gene mutations analysis. A: exon 19. Amino acid L747-A750del; B: exon 21, Nucleotide 2573 T＞G.

35例原發(fā)NSCLC病灶與相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶配對標(biāo)本中，11例（31.43%, P=0.008）標(biāo)本出現(xiàn)原發(fā)灶EGFR基因突變，而轉(zhuǎn)移灶為EGFR基因野生型，18對原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶均為EGFR基因突變型，且突變具體位點(diǎn)相同，6對原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶均為EGFR基因野生型。研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的EGFR基因表達(dá)存在不一致性，其不一致率為31.43%（11/35, P=0.008）。

3 討論

在晚期NSCLC患者中EGFR突變者對TKI治療的反應(yīng)率及PFS均較EGFR野生型者明顯升高。檢測EGFR基因突變來篩選獲益于TKI治療的患者已經(jīng)推廣使用。目前轉(zhuǎn)移病灶的EGFR基因狀況是否與原發(fā)病灶保持一致尚不明確。當(dāng)晚期NSCLC患者在決定是否使用EGFR TKI治療時，進(jìn)行EGFR基因突變狀況檢測，是否原發(fā)病灶與轉(zhuǎn)移病灶同時檢測更合適，也無法定論。

本研究比較了NSCLC原發(fā)病灶與相應(yīng)轉(zhuǎn)移病灶之間EGFR基因突變狀況的一致性，共檢測了35對配對的原發(fā)肺癌病灶與相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶的EGFR基因。研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的EGFR基因表達(dá)存在不一致性。入組病例中有11例（31.43%）出現(xiàn)原發(fā)灶EGFR基因突變，而其對應(yīng)的轉(zhuǎn)移灶為EGFR基因野生型。這一發(fā)現(xiàn)與最近幾項同類研究的結(jié)果相似， Park和Gow等研究結(jié)果顯示在NSCLC原發(fā)灶與相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶之間EGFR基因表達(dá)的不一致率分別為11.9%（12/101，直接測序法），16.8%（17/101，異源雙鏈分析法）[17]、27%（18/67，TaqMan RT-PCR法)[18]、33%（16/45，免疫組化）[19]、28%（7/25，直接測序法）[20]。各個實(shí)驗(yàn)檢測EGFR基因突變的方法不同及病例入組標(biāo)準(zhǔn)的差異可能是造成不一致率存在差異的原因。

表 1 原發(fā)灶與相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶的EGFR基因突變狀況Tab 1 EGFR mutations in primary and corresponding metastatic tumors

然而，某些研究卻發(fā)現(xiàn)相反的結(jié)果。Matsumoto在研究中有8例肺腺癌腦轉(zhuǎn)移灶患者可找到相應(yīng)的肺部原發(fā)病灶，其中6例腦轉(zhuǎn)移灶和肺部原發(fā)病灶均為EGFR基因突變型，表達(dá)一致[25]。另一個研究[26]對比8例肺癌患者原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的基因表達(dá)，EGFR基因、KRAS、P53在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間都保持了一致性。然而這些研究的入組病例數(shù)都很少。

EGFR TKI治療在EGFR基因突變型晚期NSCLC患者中有明顯療效，能有效延長PFS、提高生活質(zhì)量[11-16]。TKI治療是否是晚期肺癌患者合適的治療，根據(jù)EGFR突變類型來選擇是關(guān)鍵，然而EGFR基因在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間存在著不一致性，所以如果對肺癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶同時進(jìn)行EGFR基因檢測，可能對患者的治療有更好的指導(dǎo)意義。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在NSCLC原發(fā)病灶與轉(zhuǎn)移灶之間的EGFR基因狀況的不一致率為31.43%。這種原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶EGFR基因狀況的不一致性可能對晚期NSCLC患者選擇EGFR TKI治療有一定程度的影響，同時也是將來相關(guān)臨床試驗(yàn)設(shè)計時需考慮到的因素之一，尚有待大樣本量的研究來進(jìn)一步驗(yàn)證其臨床意義。