劉坤，姚陽

(沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034)

腦出血 (intracerebral hemorrhage，ICH)后腦水腫是ICH患者病情惡化和死亡的主要原因，凝血酶 (thrombin，TH)在ICH后腦水腫的形成中發(fā)揮重要作用。水蛭素是特異性的TH抑制劑，能與TH快速結(jié)合使其喪失活性［1］，因而具有減輕水腫的作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。研究表明，TH與 ICH后的血腦屏障 (blood brain barrier，BBB)破壞有關(guān)，緊密連接相關(guān)蛋白claudin－5的表達(dá)與BBB的通透性改變密切相關(guān)。我們的研究旨在證明水蛭素是否可以通過調(diào)節(jié)claudin－5的表達(dá)，進(jìn)而改變BBB通透性而減輕ICH后腦水腫的程度。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠60只，體重260～300 g，沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;戊巴比妥鈉 (Sigma，美國);小鼠抗claudin－5單克隆抗體(Santa Cruz公司);山羊抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗 (北京中山生物技術(shù)公司)，伊文思藍(lán) (Evans blue，EB，F(xiàn)luka公司進(jìn)口分裝)，水蛭素 (上海太陽生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 健康Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、ICH組、水蛭素組。各組大鼠于術(shù)后48h取腦組織分別檢測BBB通透性及claudin－5蛋白表達(dá)情況。各時(shí)間點(diǎn)均取20只大鼠分別進(jìn)行各項(xiàng)檢測。

1.2.2 動(dòng)物模型制作 參照Rosenberg等的方法進(jìn)行。大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，固定于立體定位儀上，行頭部正中縱行切口，剝離骨膜暴露前囟和冠狀縫。于前囟前0.2 mm，中線向右旁開3.0 mm處鉆一直徑1.0 mm小孔。ICH組大鼠用微量注射器從股動(dòng)脈抽取適量血，在立體定向儀引導(dǎo)下經(jīng)鉆孔垂直進(jìn)針，深度約6.0 mm(相當(dāng)于右側(cè)尾狀核)，緩慢注血75 μl，留針10 min后退針并再注入3 μl生理鹽水;水蛭素組注血75 μl后再注入含15 U水蛭素的生理鹽水3 μl;對(duì)照組僅注入78 μl生理鹽水。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 EB含量的測定 各組大鼠均于處死前1 h于股靜脈注射2%EB 3 ml/kg。斷頭取腦組織，將其放入培養(yǎng)皿中，以防水分蒸發(fā)。取損傷區(qū)中心腦組織100 mg左右，稱重后放入存有3 ml二甲基甲酰胺的試管中，60℃水浴中 (避光)抽提24 h。1 500g離心10 min，取上清，應(yīng)用RF－540熒光分光光度計(jì) (λ=632 nm)測定 EB熒光光度值(OD)，蒸餾水作為空白對(duì)照。根據(jù)光密度數(shù)值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上算出腦組織中EB含量，以EB含量(μg/g濕腦組織)代表BBB通透性的改變。

1.3.2 腦組織claudin－5蛋白表達(dá) 大鼠過量麻醉致死后，迅速斷頭，提取缺血區(qū)腦額頂葉組織蛋白，勻漿離心、測定蛋白濃度;蛋白分離采用10%十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecylsulfonate－polyacrylate gel electrophoresis，SDS－PAGE)電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上;claudin－5(1∶500 稀釋)、β－actin 抗體 (1∶5 000 稀釋)，4℃孵育過夜;相應(yīng)二抗室溫孵育2h;增強(qiáng)化學(xué)熒光反應(yīng) (enhanced chemiluminescene，ECL)發(fā)光，采用Chemi Imager 5500V 2.03軟件掃描膠片，F(xiàn)luor Chem 2.0圖像分析儀對(duì)條帶積分光密度進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 BBB通透性改變 應(yīng)用EB滲透性實(shí)驗(yàn)評(píng)估BBB通透性變化。與對(duì)照組相比，ICH組和水蛭素組腦組織EB含量于ICH后48 h時(shí)明顯升高 (P＜0.01);水蛭素組腦組織EB含量低于ICH組(P＜0.01)(表1)。

圖1 ICH后腦組織中claudin－5蛋白表達(dá)

2.2 腦組織claudin－5蛋白表達(dá)改變 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組ICH后48 h claudin－5蛋白表達(dá)明顯減少 (P＜0.01);水蛭素組claudin－5蛋白表達(dá)高于ICH組 (P＜0.01)(圖1，表1)。

表1 ICH后腦組織EB含量及claudin－5蛋白表達(dá) (±s)

表1 ICH后腦組織EB含量及claudin－5蛋白表達(dá) (±s)

注：1)與對(duì)照組相比，P＜0.01;2)與ICH組相比，P＜0.01

組別 EB含量 (μg/g) 相對(duì)光密度值(claudin－5/β－actin)對(duì)照組0.189±0.021 0.581±0.153 ICH組 0.773±0.0161) 0.165±0.0311)水蛭素組 0.415±0.0181)2) 0.390±0.0531)2)

3 討論

TH是一種多功能絲氨酸蛋白酶，由無活性的凝血酶原活化而來。研究表明，TH在ICH后腦水腫形成過程中起關(guān)鍵作用。TH的特異性抑制劑水蛭素可以有效抑制這種腦水腫的發(fā)生。目前認(rèn)為，后期腦水腫 (出血后24 h以后)主要與TH破壞BBB有關(guān)。亦有研究表明，ICH后24～48 h時(shí)腦水含量最多，這時(shí) BBB通透性達(dá)到峰值［2，3］。因此，本研究取ICH后48h這一時(shí)間點(diǎn)觀察水蛭素對(duì)BBB及緊密連接蛋白claudin－5表達(dá)的影響。

內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接是構(gòu)成BBB的重要部分?？缒さ鞍譪laudins是緊密連接復(fù)合物的主要構(gòu)成成分，參與維持緊密連接的選擇滲透性和細(xì)胞極化［4］。其中，claudin－5是腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性調(diào)節(jié)的最重要調(diào)節(jié)因子［5］，因此，claudin－5對(duì)BBB通透性可能起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ICH后48 h，BBB通透性顯著升高，水蛭素可以降低ICH后期BBB的通透性;同時(shí)claudin－5表達(dá)顯著減少，水蛭素可使 ICH后期claudin－5表達(dá)明顯增加。這一結(jié)果提示，水蛭素可能通過上調(diào)claudin－5表達(dá)，使BBB通透性降低，從而減輕ICH后期的腦水腫程度。

TH對(duì)細(xì)胞作用是通過與細(xì)胞膜結(jié)合的TH受體 (thrombin receptor，TR)介導(dǎo)的。TH可通過激活 TR引起酪氨酸酶的活化，再激活GTP結(jié)合蛋白 RhoA［6］，RhoA 激活導(dǎo)致 claudin－5 表達(dá)減少［7］。Ishizaki等的研究證明，cAMP可以通過依賴或非依賴蛋白激酶A途徑，通過蘇氨酸磷酸化而上調(diào)豬BBB上chudin－5的表達(dá)，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞上緊密連接的功能［8］。TH與其受體結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度降低［9］，因而具有下調(diào)claudin－5表達(dá)的作用。TH是一種重要的前炎癥因子，可上調(diào)炎 性 細(xì) 胞 因 子 的 表 達(dá)，如 IL－1、TNF－α［10］。Kawakita等研究發(fā)現(xiàn)TH可促進(jìn)MMP－9的表達(dá)和激活［11］。這些因子的表達(dá)和激活均能引起claudin－5表達(dá)減少［12，13］。我們推測，水蛭素可能通過與TH結(jié)合，抑制其對(duì)酪氨酸酶的活化及對(duì)炎性因子和MMP－9的調(diào)節(jié)，增加claudin－5的表達(dá)，使緊密連接關(guān)閉，BBB通透性下降，而發(fā)揮減輕腦水腫的作用，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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