于永燕，于 丁

（1.河?xùn)|社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000）

急性心肌梗死最有效的治療是有效恢復(fù)缺血心肌的血液灌注，近年來(lái)，再灌注治療包括溶栓治療和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療等取得很大進(jìn)展，已成為急性心肌梗死治療的有效手段。然而，大量研究證實(shí)，心肌缺血再灌注同時(shí)可能帶來(lái)心肌再灌注損傷，后者可能抵消早期再灌注所帶來(lái)的益處甚至加重心肌損害。氧自由基是造成缺血再灌注損傷的直接原因[1]。黃連素是毛莨科植物黃連干燥根莖的提取物之一，近年發(fā)現(xiàn)其對(duì)心血管系統(tǒng)有明顯作用，但其對(duì)家兔心肌缺血再灌注損傷的作用少見報(bào)道[2]。本實(shí)驗(yàn)研究黃連素對(duì)家兔在體心肌缺血再灌注損傷的作用，并探討其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料

（1）動(dòng)物：新西蘭大白兔，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量（2.0±0.2）kg。（2）藥品和試劑：黃連素購(gòu)自J&K化學(xué)公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自美國(guó)sigma公司；肌酸磷酸激酶（CPK）測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、NO（一氧化氮）試劑盒、NOS（一氧化氮合酶）試劑盒和考馬斯亮蘭試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 動(dòng)物選用新西蘭大白兔，用戊巴比妥鈉30 mg/kg從兔耳緣靜脈注入進(jìn)行麻醉，采用背位固定于手術(shù)臺(tái)上，分離氣管并插管，剪去胸部毛，酒精消毒，沿胸骨正中線行胸正中切口，剝?nèi)バ丶?，找?～4肋骨，進(jìn)入胸腔，用開胸器撐開切口，暴露心臟，用止血鉗輕輕提起左心耳，在左心耳根部下方約3 mm進(jìn)針，穿絲線縫扎冠狀動(dòng)脈左前降支，40 min后打開結(jié)扎線使冠脈灌流再通2 h[3]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 新西蘭大白兔35只，隨機(jī)分組，每組7只，共分5組：（1）假手術(shù)組：只繞冠狀動(dòng)脈左旋支穿線，不結(jié)扎，給予水。測(cè)梗死范圍時(shí)不設(shè)假手術(shù)組。（2）缺血再灌注組：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左旋支40 min后，剪開結(jié)扎線，再灌注2 h。（3）黃連素小劑量組3 mg/kg。（4）黃連素中劑量組6 mg/kg。（5）黃連素大劑量組12 mg/kg，灌胃給藥，用藥體積均為1 mL/ kg，每日給藥1次，術(shù)前給藥1周。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 家兔血漿CPK、SOD活性和MDA含量測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即從家兔左頸總動(dòng)脈取血，并用肝素抗凝，然后3 000 r/min 離心15 min，取上清液，按試劑盒步驟要求測(cè)CPK、SOD活性和MDA含量。

1.3.2 心肌組織中NO含量和NOS活性測(cè)定 取血后迅速剪取家兔心臟，用4℃生理鹽水沖凈血液后，取結(jié)扎點(diǎn)以下梗死心肌組織，加入0.1 mol/L PBS，冰浴下制成心肌組織勻漿，3 000 r/min 離心15 min，取上清液按試劑盒要求步驟測(cè)量NO含量和NOS活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃連素對(duì)缺血再灌注家兔血漿CPK、SOD活性和MDA含量的影響（見表1）

表1 黃連素對(duì)缺血再灌注損傷后血漿MDA含量和SOD、CPK活性的影響

如表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組MDA含量和CPK活性的明顯增加，SOD的活性明顯降低。黃連素組與模型比較，血漿MDA含量和CPK活性降低，SOD的活性明顯增加。

2.2 黃連素對(duì)缺血再灌注家兔心肌組織NO含量和NOS活性的影響（見表2）

表2 黃連素對(duì)缺血再灌注損傷后心肌組織NO含量和NOS活性的影響（，n=7）

表2 黃連素對(duì)缺血再灌注損傷后心肌組織NO含量和NOS活性的影響（，n=7）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 NO（μmol/g） T-NOS（U/mg） i-NOS（U/mg）假手術(shù)組 47.32±11.21 0.72±0.23 0.37±0.07模型組 25.15±5.97** 0.46±0.09** 0.30±0.08黃連素小劑量組 27.31±6.21 0.49±0.12 0.34±0.05黃連素中劑量組 30.18±6.16 0.53±0.13 0.36±0.06黃連素大劑量組 35.27±7.12# 0.58±0.11# 0.35±0.07##

如表2所示，與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織NO的含量和T-NOS的活性明顯降低。黃連素組與模型組比較，心肌組織NO含量和T-NOS的活性增加，iNOS活性各組間無(wú)明顯差別。

3 討論

隨著冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)、激光冠狀動(dòng)脈再通術(shù)等在臨床上的廣泛應(yīng)用，心肌缺血再灌注損傷越來(lái)越受到心血管病醫(yī)生的重視。它是指在缺血再灌注后心肌損傷反而進(jìn)一步加重并引起細(xì)胞死亡。缺血再灌注后心肌酶釋放多少是反映心肌損害程度的重要指標(biāo)，心肌酶CPK等存在于心肌細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)溢出會(huì)增多，CPK溢出越多，血漿中活性越高。在實(shí)驗(yàn)中，缺血再灌注組CPK含量較假手術(shù)組組明顯增高，說(shuō)明缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重[4,5]。在實(shí)驗(yàn)中，我們可以看到，黃連素可減低心肌缺血再灌注后CPK含量，提示黃連素可保護(hù)心肌細(xì)胞。

缺血再灌注損傷可能與再灌注時(shí)生成大量氧自由基和鈣超載或鈣再分布等有關(guān)。超氧化物歧化酶（SOD）是體內(nèi)清除自由基的一類主要的酶，其活性降低可引起氧自由基的積聚，從而使細(xì)胞及亞細(xì)胞的膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，引起脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）水平升高，丙二醛的增多可引起DNA、蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)造成細(xì)胞損傷，是心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。因此，SOD 和MDA 的水平可反映氧化應(yīng)激反應(yīng)程度的指標(biāo)，也反映了機(jī)體清除氧自由基的能力[6-8]。在實(shí)驗(yàn)中，模型組缺血再灌注后，MDA含量明顯增高，SOD活性降低，說(shuō)明心肌缺血再灌注后，產(chǎn)生大量的氧自由基，介導(dǎo)了細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，消耗了SOD，我們檢測(cè)了黃連素對(duì)缺血再灌注后血漿SOD和MDA的影響，結(jié)果顯示，黃連素可降低MDA含量，升高SOD活性。這些結(jié)果均揭示黃連素可增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力，減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

NO含量升高可引起冠脈擴(kuò)張，冠狀血流增加，另外NO也發(fā)揮抗氧化作用，使內(nèi)皮細(xì)胞免受氧自由基的損傷，維持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，進(jìn)而減少中性粒細(xì)胞的粘附。NOS是NO合成的限速酶，和缺血再灌注損傷關(guān)系比較密切的NOS有iNOS（誘導(dǎo)型）、和eNOS（內(nèi)皮細(xì)胞型NOS）[9]。本試驗(yàn)中，在缺血再灌注損傷后可檢測(cè)到心肌組織NO的含量和T-NOS活性的降低，黃連素則可提高缺血再灌注損傷后心肌組織NO的含量和T-NOS的活性，從而發(fā)揮對(duì)兔心肌缺血灌注損傷的保護(hù)作用。但對(duì)iNOS影響并不大，因此，本實(shí)驗(yàn)中，黃連素升高NO的含量可能主要與升高eNOS活性有關(guān)。

[1] Kin H,Zhao ZQ,Sun HY,et al.Postconditioning attenuates myocardialischemia reperfusion injury by inhibiting events in the early minutes of reperfusion[J].Cardiovasc Res,2004,62(1)：74-85.

[2] 付明耀.小檗堿的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,4(3)：87-89.

[3] 陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1993：532-534.

[4] Vinten-Johansen J,Zhao ZQ,Jiang R,et al.Myocardial protection in reperfusion with postconditioning[J].Expert Rev Cardiovasc Ther,2005,3(6)：1 035-1 045.

[5] Loubele ST,Spek CA,Leenders P,et al.Activated protein C protects against myocardial ischemia/reperfusion injury via inhibition of apop tosis and inflammation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2009,29：1 087-1 092.

[6] Bilir A,Erkasap N,Koken T,et al.Effects of tramadol on myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Scand Cardiovasc J,2007,41(4)：242-247.

[7] Yang XM,Proctor JB,Cui L,et al.Multiple brief coronary occlusions during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways[J].Am Coll Cardiol,2004,44(5)：1 103-1 110.

[8] Zhao ZQ,Corvera JS,Vinten JJ,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2)：579-588.

[9] Di Filippo C,Luongo M,Marfella R,et al.Oxygen/ozone protects the heart from acute myocardial infarction through local increase of eNOS activity and endothelial progenitor cells recruitment[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2010,382(3)：287-291.