楊小清，鄭少雄

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211)

凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)主要在血管內(nèi)皮表面表達(dá)，動(dòng)脈粥樣硬化病變血管LOX-1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，氧化應(yīng)激是血管內(nèi)皮LOX-1表達(dá)的重要原因。普羅布考具有較強(qiáng)的抗氧化作用，從而具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。2006年1月～2007年12月，我們對(duì)普羅布考對(duì)2型糖尿病大鼠大血管病變處LOX-1表達(dá)的影響及其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型的制備 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量約220 g，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部試驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為A、B、C和D四組。A組為正常對(duì)照組(10只)，給予普通飲食;B、C和D組為高糖高脂飼養(yǎng)組，8周后給予小劑量STZ造糖尿病模型。其中B組(13只)在高糖高脂飲食起始的同時(shí)給予普羅布考干預(yù);C組(13只)在高糖高脂飲食8周并行小劑量STZ造模后給予普羅布考干預(yù)8周;D組(14只)在造模前后均給予高糖高脂飲食，不給普羅布考干預(yù)。空腹血糖測(cè)定結(jié)果＞16.7 mmol/L為2型糖尿病造模成功。

1.2 原位活性氧(ROS)水平及LOX-1mRNA、蛋白水平的檢測(cè) 造模后8周所有動(dòng)物稱量，取血測(cè)定血糖、血脂，并處死動(dòng)物，取主動(dòng)脈弓處血管進(jìn)行鏡下觀察及ROS、LOX-1測(cè)定。ROS 測(cè)定采用免疫熒光法。LOX-1 mRNA行RT-PCR半定量測(cè)定，采用VDS450型凝膠影像分析系統(tǒng)采集圖像并行LOX-1/β-actin比值的半定量分析。LOX-1蛋白含量測(cè)定用Lowry法(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)，對(duì)LOX-1和內(nèi)參β-actin特異性條帶的Western blot產(chǎn)物各條帶灰度進(jìn)行定量分析，再按照公式計(jì)算相對(duì)灰度［相對(duì)灰度=(試驗(yàn)組檢測(cè)蛋白的灰度值×對(duì)照組β-actin的灰度值)/(對(duì)照組檢測(cè)蛋白的灰度值 ×該組β-actin的灰度值)］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模前后各組大鼠生化指標(biāo)比較 高糖高脂灌胃8周后大鼠存在胰島素抵抗，造模后大鼠血糖水平明顯高于A組(P＜0.05)，且空腹血糖＞16.7 mmol/L，表明模擬2型糖尿病造模成功。B、C、D組血糖、血清TG、TC和LDL-C水平明顯高于A組(P均＜0.05)。C、B組的TC和 LDL-C水平明顯低于D 組(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠ROS結(jié)果 A組大鼠主動(dòng)脈原位ROS含量的熒光強(qiáng)度弱，熒光密度較低，能看見(jiàn)組織間隙;D組主動(dòng)脈原位ROS含量的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，在顯微鏡下其熒光強(qiáng)度刺眼，以內(nèi)膜及平滑肌層處強(qiáng)度最強(qiáng)，看不見(jiàn)組織間隙，表明其ROS水平4組中最高，且明顯高于A組;B、C組主動(dòng)脈原位ROS含量熒光強(qiáng)度處于前兩者之間，鏡下可見(jiàn)較強(qiáng)的熒光，表明普羅布考干預(yù)治療可以減低糖尿病大鼠主動(dòng)脈原位ROS水平。

表1 造模前后各組大鼠生化指標(biāo)比較(mmol/L，)

表1 造模前后各組大鼠生化指標(biāo)比較(mmol/L，)

注:與 A 組比較，*P ＜0.05;與 D 組造模后比較，△P ＜0.05

組別 n 血糖TG TC HDL-C LDL-C A 組 10 5.64 ±0.61 0.72 ±0.19 2.39 ±0.76 1.10 ±0.37 1.14 ±0.29 B組造模前 13 5.52 ±0.33 2.63 ±1.30 6.88 ±1.53 1.04 ±0.42 4.80 ±1.23造模后 6 28.85 ±6.00* 5.11 ±1.39* 10.15 ±3.19＊△ 1.08 ±0.33 8.34 ±3.15＊△C組造模前 13 5.53 ±0.53 2.63 ±1.01 6.72 ±1.61 0.96 ±0.32 5.28 ±1.29造模后 8 29.91 ±5.68* 5.13 ±1.67* 9.67 ±3.34＊△ 1.00 ±0.27 7.67 ±2.56＊△D組造模前 14 5.51 ±0.53 2.64 ±1.00 6.75 ±1.64 0.97 ±0.34 5.30 ±1.27造模后 7 30.93 ±4.59* 4.83 ±1.05* 14.64 ±3.45* 0.96 ±0.20 12.57 ±3.21*

2.3 LOX-1 mRNA、LOX-1蛋白測(cè)定結(jié)果 D組大鼠主動(dòng)脈組織LOX-1 mRNA、LOX-1蛋白表達(dá)明顯高于A組，普羅布考干預(yù)可以減少糖尿病大鼠主動(dòng)脈組織的LOX-1 mRNA、LOX-1蛋白水平，而造模前提前給予普羅布考干預(yù)不能進(jìn)一步降低其mRNA及蛋白水平。見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠主動(dòng)脈血管組織LOX-1 mRNA及蛋白表達(dá)()

表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠主動(dòng)脈血管組織LOX-1 mRNA及蛋白表達(dá)()

注:與 A 組比較，*P ＜0.05;與 B、C 組比較，△P ＜0.05

組別 n LOX-1 mRNA灰度值 LOX-1蛋白灰度值A(chǔ)組9 0.55 ±0.05 0.69 ±0.05 B 組 6 0.80 ±0.06* 0.79 ±0.06*C 組 8 0.81 ±0.05* 0.81 ±0.05*D 組 7 0.93±0.04＊△ 0.96 ±0.07＊△

3 討論

LOX-1作為一種細(xì)胞表面受體，主要發(fā)揮對(duì)Ox-LDL的胞吞作用，其活化會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂［1］，是動(dòng)脈粥樣硬化病變的關(guān)鍵因素［2］和始動(dòng)環(huán)節(jié)。一方面，LOX-1的上調(diào)，會(huì)導(dǎo)致ox-LDL與LOX-1結(jié)合、攝入內(nèi)皮細(xì)胞增加，進(jìn)一步導(dǎo)致:NF-κB 的激活，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂［3］;Fas活性增加，內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡增加［4］;P-選擇素、VCAM、ICAM的水平上調(diào)，單核細(xì)胞的黏附增強(qiáng)［5］、向內(nèi)膜的遷移增強(qiáng)［6］，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，泡沫細(xì)胞形成，最終形成典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。體內(nèi)可溶性LOX-1的測(cè)定可能有助于對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和血管疾病的評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)［7］。另一方面LOX-1活化還誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)的表達(dá)［8］，其機(jī)制是通過(guò)P38MAPK 通路來(lái)完成的［9］。

本研究中，各組大鼠主動(dòng)脈原位ROS水平與該處內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1基因及蛋白表達(dá)水平是平行的，且抗氧化劑普羅布考治療組的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1基因和蛋白表達(dá)水平明顯下降，其進(jìn)一步證實(shí)氧化應(yīng)激對(duì)LOX-1具有重要的調(diào)控作用。大量研究亦證實(shí)氧化應(yīng)激在LOX-1的表達(dá)中發(fā)揮重要作用。研究證明，丙二醛［10］、ROS可以明顯上調(diào)人血管內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1的表達(dá)，LOX-1的表達(dá)水平可以在多種病理情況下上調(diào)，如高血壓、高血脂［11］，甚至是動(dòng)脈粥樣硬化本身［12］。在這些病理情況下，脈管系統(tǒng)內(nèi)高水平的ROS可能是在這些環(huán)境下導(dǎo)致LOX-1上調(diào)的潛在機(jī)制。

本研究顯示，LOX-1在糖尿病大鼠大血管病變?cè)缙诩匆延忻黠@的高表達(dá)，這種高表達(dá)可能在大血管的病變中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其機(jī)制可能與糖尿病大血管處的原位ROS有關(guān)，并且抗氧化治療可能是糖尿病大血管病變的一個(gè)新的有效手段。但是，糖尿病環(huán)境下ROS/LOX-1通路還有哪些中間環(huán)節(jié)，有待在以后的研究中進(jìn)一步明確。

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