徐晟偉，沈若武，張 蓓

(1青島市第三人民醫(yī)院，山東 青島 266021;2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。有學(xué)者認(rèn)為該病是一系列免疫反應(yīng)引起，與氣道炎癥、氧化反應(yīng)等因素有關(guān)［1］。IL-2是一個(gè)與感染密切相關(guān)的細(xì)胞因子，它在機(jī)體啟動(dòng)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中起著放大作用［2］。本研究通過(guò)測(cè)定COPD患者血清中 IFN-γ、IL-2濃度以及 IL-2對(duì)CD8+T細(xì)胞頻率和功能的影響，以期為臨床治療COPD提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究78例均為2008年11月～2010年5月青島市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院患者，均符合2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)COPD診治規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。按疾病的不同嚴(yán)重程度及不同時(shí)期將COPD患者分為急性發(fā)作期組45例、臨床緩解期組33例。其中急性發(fā)作期組男28例、女17例，年齡55～81(62.4 ±7.9)歲;臨床緩解期男18 例、女15 例，年齡57～78(64.2±5.6)歲。排除有支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核、肺間質(zhì)纖維化等病史者。另選同期來(lái)我院查體健康者25例為對(duì)照組，其中男18例、女7 例，年齡(64.1 ±9.1)歲;均無(wú)吸煙史。

1.2 方法

1.2.1 IL-2、IFN-γ血清濃度檢測(cè) 采用雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)受試者血清IL-12、IFN-γ水平。取受試者血清及標(biāo)準(zhǔn)液各50 μl加入酶標(biāo)板，37℃孵育30 min;每孔加酶標(biāo)抗體 50 μl，37℃孵育 30 min。洗滌5次加底物顯色;終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀測(cè)OD值。

1.2.2 IL-2對(duì)CD8+T細(xì)胞頻率的影響檢測(cè) ①外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的提取:取淋巴細(xì)胞分離液加入離心管，毛細(xì)吸管加入等量的倍比稀釋血液，水平離心25 min。毛吸管輕輕吸取白膜層PBMC，洗滌后用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，培養(yǎng)于6孔板中備用。PBMC分為以下兩組:IL-2刺激組，加入 IL-220 μl刺激;未刺激組，不加任何細(xì)胞因子刺激。孵育10 d后，檢測(cè)CD8+T細(xì)胞頻率。②CD8+T細(xì)胞頻率檢測(cè):肝素抗凝全血200 μl加2 ml PBS 稀釋后，1000 r/min 離心 5 min后移棄上清;加20 μl PE 標(biāo)記的 CD3、20 μl FITC 標(biāo)記的CD8抗體于全血細(xì)胞中，設(shè)置同型對(duì)照;室溫避光孵育30 min，然后洗滌;加FACS裂解液室溫10 min;待細(xì)胞懸液變成真性溶液后洗滌2次;1 g/ml多聚甲醛200 μl重懸固定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，專用軟件分析。③胞內(nèi)IFN-γ染色提取的PBMC設(shè)不同刺激組，10 d后加入 20 μl PE 標(biāo)記的 CD3、20 μl FITC標(biāo)記的CD8單克隆抗體及同型對(duì)照，室溫避光孵育20 min;加入500 μl 1× FACSTM TM 穿透液，室溫下避光孵育15 min，洗滌1次;分別加入20 μl熒光標(biāo)記的IFN-γ抗體及同型對(duì)照，室溫下避光孵育20 min;洗滌2次，重懸于200 μl 1%多聚甲醛，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)富含IFN-γ的CD8+T細(xì)胞頻率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件;樣本均數(shù)以表示;組間比較應(yīng)用單因素方差分析或配對(duì)t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清中IL-2、IFN-γ濃度 COPD患者急性發(fā)作期血清IFN-γ、IL-2濃度較臨床緩解期組和對(duì)照組顯著增高(P均＜0.01)。臨床緩解期組血清IFN-γ、IL-2濃度低于急性發(fā)作期組，但仍高于對(duì)照組(P均＜0.01)。見表1。

表1 三組血清IL-2、IFN-γ濃度測(cè)定結(jié)果 (ng/L，)

表1 三組血清IL-2、IFN-γ濃度測(cè)定結(jié)果 (ng/L，)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01;與臨床緩解期組比較，△P ＜0.01

組別 n IL-2 IFN-γ急性發(fā)作期組 45 14.72±3.56＊△ 30.36±5.04＊△臨床緩解期組 33 8.41 ±2.97* 16.28 ±4.39*對(duì)照組25 4.86 ±2.26 10.33 ±3.44

2.2 IL-2刺激組及未刺激組CD8+T細(xì)胞頻率IL-2刺激組及未刺激組CD8+T細(xì)胞頻率分別為(42.76 ±3.75)%、(36.71 ±2.81)%。與未刺激組相比，IL-2刺激組 CD8+T細(xì)胞頻率增加(P＜0.05)。

2.3 IL-2刺激組及未刺激組CD8+IFN-γ+T細(xì)胞頻率 IL-2刺激組及未刺激組CD8+IFN-γ+T細(xì)胞頻率分別為(2.12 ±0.35)%、(1.31 ±0.2)%。與未刺激組相比，加入IL-2刺激組CD8+IFN-γ+T細(xì)胞頻率顯著增加(P＜0.05)。

3 討論

COPD是一種由各種細(xì)胞產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，其氣道炎癥以T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征;在COPD患者的痰液和支氣管肺泡灌洗液中這些細(xì)胞的數(shù)量增加也說(shuō)明了這一點(diǎn)［3］。由于COPD是由多種炎性細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)性慢性炎癥，所以有關(guān)COPD炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)過(guò)程中的細(xì)胞因子已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

IL-2、IFN-γ被認(rèn)為是機(jī)體復(fù)雜免疫網(wǎng)絡(luò)中起調(diào)節(jié)作用的重要細(xì)胞因子。IL-2屬抗炎癥因子，其主要生物活性是刺激自然殺傷細(xì)胞增殖與分化并殺滅微生物［4］;而IFN-γ是細(xì)胞免疫的重要效應(yīng)因子，是CD8+T細(xì)胞殺滅病原微生物的重要方式之一。另外，IFN-γ能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，促進(jìn)THI細(xì)胞增生與活化，可介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)AMs的激活，刺激AMs分泌細(xì)胞因子［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示COPD患者血清中IL-2、IFN-γ水平明顯高于對(duì)照組，這與國(guó)外其他學(xué)者的報(bào)道一致［6］。而在臨床緩解期，隨著感染的緩解和控制，其釋放量也相應(yīng)減少，從而進(jìn)一步說(shuō)明IL-2、IFN-γ參與了COPD發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。

目前的研究顯示，在COPD患者的氣道壁中，浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞主要為CD8+T淋巴細(xì)胞，而且增加的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)與COPD患者的氣流受限程度相關(guān)，從而說(shuō)明CD8+T淋巴細(xì)胞在COPD氣道炎癥發(fā)展過(guò)程中起著重要作用［7］。為揭示IL-2是否通過(guò)影響CD8+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)，本研究設(shè)置不同分組觀察其對(duì)CD8+T細(xì)胞頻率的影響。結(jié)果顯示用IL-2刺激后，CD8+T細(xì)胞頻率顯著增高，說(shuō)明在COPD患者中，IL-2刺激了CD8+T細(xì)胞的增殖。

近年來(lái)研究提示，CD8+T細(xì)胞主要通過(guò)兩種途徑發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng):一種是CD8+T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的直接殺傷作用，即通過(guò)穿孔素和顆粒酶的釋放等殺傷感染細(xì)胞;另一種途徑主要是通過(guò)細(xì)胞因子的釋放，如 IFN-γ和 TNF-α等，達(dá)到其免疫殺傷的目的［8］。為驗(yàn)證IL-2在促進(jìn)CD8+T細(xì)胞頻率提高的同時(shí)是否會(huì)改善其功能，我們利用流式細(xì)胞分析技術(shù)合并胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)觀察IL-2對(duì)不同組CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ分泌情況的影響，結(jié)果顯示加入IL-2刺激后，CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ功能增強(qiáng)。

綜上所述，COPD是一種由IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子介導(dǎo)的慢性炎癥，而IL-2可通過(guò)促進(jìn)CD8+T細(xì)胞增殖，同時(shí)刺激CD8+T分泌IFN-γ參與COPD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

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