翟海龍，賴永榕

(1黃石理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003;2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

異基因外周血干細(xì)胞移植(Allo-PBSCT)是近年來(lái)臨床上廣泛采用的一種先進(jìn)的造血干細(xì)胞移植技術(shù)，對(duì)白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等惡性血液病有很好的治療效果;然而，移植物抗宿主病(GVHD)作為Allo-PBSCT一種常見(jiàn)的嚴(yán)重的并發(fā)癥長(zhǎng)期困擾著臨床。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Allo-PBSCT后 CD4+CD25+Tregs可抑制激活的T細(xì)胞而預(yù)防GVHD［1］。為此，本研究對(duì)Allo-PBSCT后CD4+CD25+Tregs體外是否有無(wú)反應(yīng)性及其抑制功能進(jìn)行了研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2004年10月～2006年5月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科行Allo-PBSCT的血液惡性腫瘤患者36例(Allo-PBSCT組)，男27例、女9例，年齡9～56歲、中位年齡34歲;其中，急性髓細(xì)胞白血病7例，急性淋巴細(xì)胞白血病9例，慢性粒細(xì)胞白血病14例，非霍奇金淋巴瘤1例，多發(fā)性骨髓瘤1例，骨髓增生異常綜合征4例。36例中，GVHD患者16例(GVHD組)，無(wú)GVHD患者20例(無(wú)GVHD組)。供者均為同胞兄弟姐妹，HLA配型6個(gè)位點(diǎn)全相合44例，1個(gè)位點(diǎn)不相合3例。對(duì)照組募集健康志愿者7例，男5例、女2例，年齡24～34歲、中位年齡28歲。在移植后+30 d采集上述Allo-PBSCT組和對(duì)照組EDTA抗凝外周血20 ml。

1.2 方法

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑、儀器 熒光單抗試劑:美國(guó)BD公司產(chǎn);CD4+CD25+Tregs分離試劑盒:德國(guó)Miltenyi生物技術(shù)公司產(chǎn);淋巴細(xì)胞分離液:上海檢測(cè)試劑公司產(chǎn);IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β、IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒:晶美生物工程有限公司產(chǎn)。EPICS-XL流式細(xì)胞儀:美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn);Midi和Mini磁性細(xì)胞分離柱、磁性細(xì)胞分離器:均為德國(guó)Miltenyi生物技術(shù)公司產(chǎn);精華牌TGL-16G型高速離心機(jī):太倉(cāng)市醫(yī)療機(jī)械廠產(chǎn)。MK3型酶標(biāo)儀:美國(guó)Thermo電子公司產(chǎn)。

1.2.2 CD4+CD25+Tregs增殖和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) ①分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。②分離CD4+CD25+Tregs。③CD4+CD25+Tregs和 CD4+CD25-T細(xì)胞的記數(shù)和純度檢測(cè):CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細(xì)胞記數(shù)前，可得到(1.0～1.1)×105個(gè) CD4+CD25+Tregs和(1.2 ～1.5)×105個(gè)CD4+CD25-T細(xì)胞。取CD4+CD25+Tregs細(xì)胞液和CD4+CD25-T細(xì)胞各100 μl行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)為CD4和CD25。如CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細(xì)胞的純度均大于80%，即可從事下面的實(shí)驗(yàn)。④離體CD4+CD25+Tregs的增殖和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng):a.細(xì)胞培養(yǎng):分別取2×104CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細(xì)胞以及2×104個(gè)CD4+CD25+Tregs與2×104個(gè)CD4+CD25-T細(xì)胞混合3組細(xì)胞構(gòu)成1個(gè)大組，建立2個(gè)大組;將這2個(gè)大組加入到96孔培養(yǎng)板的6個(gè)孔中，再加入RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液 200 μl，10% 小牛血清，10 μg/ml可溶性抗 CD3-mAbs 試劑 2 μl，5 μg/ml抗CD28-mAbs試劑4 μl，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。b.檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量:取1個(gè)大組的3個(gè)孔每孔加入10 μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，取出后置于酶標(biāo)儀上450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD450值。c.顯微攝影(×100)。

1.2.3 CD4+CD25+Tregs 離體分泌和抑制 CD4+CD25-T細(xì)胞分泌實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，將3個(gè)孔的細(xì)胞液移至0.5 μl離心管中用高速離心機(jī)以5000 r/min離心10 min。吸取上清液于0.5 ml的離心管中，編號(hào)后將離心管置于-70℃的低溫冰箱中，待積累到47例份后用雙抗體夾心ELISA 法測(cè)其 IL-10、TGF-β、IFN-γ細(xì)胞因子的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4+CD25+Tregs和 CD4+CD25-T細(xì)胞的純度 本實(shí)驗(yàn)中CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細(xì)胞的純度均大于80%。

2.2 CD4+CD25+Tregs的無(wú)反應(yīng)和抑制實(shí)驗(yàn) 有無(wú)GVHD患者和對(duì)照組CD4+CD25+Tregs OD450值極低，均與本組CD4+CD25-T細(xì)胞有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。表明有無(wú) GVHD患者 CD4+CD25+Tregs在抗CD3-mAbs和抗CD28-mAbs的共同刺激下不增殖，表現(xiàn)出與正常對(duì)照組人群CD4+CD25+Tregs類似的無(wú)反應(yīng)性特征。同樣，有無(wú)GVHD患者混合細(xì)胞也有類似特征。見(jiàn)表1。

表1 CD4+CD25+Tregs的無(wú)反應(yīng)和抑制實(shí)驗(yàn)(OD450值，)

表1 CD4+CD25+Tregs的無(wú)反應(yīng)和抑制實(shí)驗(yàn)(OD450值，)

注:與本組CD4+CD25-T細(xì)胞比較，*P＜0.01

組別 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T細(xì)胞 混合細(xì)胞對(duì)照組 70.052 ±0.008* 1.780 ±0.5370.529 ±0.074*GVHD 組 160.048 ±0.009* 1.732 ±0.7410.607 ±0.058*無(wú) GVHD 組 200.049 ±0.011* 1.695 ±0.6280.572 ±0.063*

2.3 CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制 CD4+CD25-T細(xì)胞分泌實(shí)驗(yàn) 有無(wú)GVHD患者離體CD4+CD25+Tregs在抗CD3-mAbs和抗CD28-mAbs的共同刺激下分泌的 IL-10、TGF-β和 IFN-γ低于CD4+CD25-T細(xì)胞(P＜0.01)，有無(wú) GVHD 患者兩細(xì)胞混合分泌的這3種細(xì)胞因子均低于CD4+CD25-T細(xì)胞(P＜0.05)。這些均與對(duì)照組類似。見(jiàn)表 2、3、4。

3 討論

表2 各組CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T細(xì)胞分泌 IL-10結(jié)果(mmol/L，)

表2 各組CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T細(xì)胞分泌 IL-10結(jié)果(mmol/L，)

注:與同組CD4+CD25-T細(xì)胞比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T細(xì)胞 混合細(xì)胞對(duì)照組 7 6.67 ±2.58＊＊ 35.71 ±5.28 22.57 ±4.82*GVHD 組 1611.52 ±4.89＊＊ 41.06 ±5.59 25.34 ±5.02*無(wú) GVHD 組 2010.25 ±3.21＊＊ 38.65 ±4.39 26.37 ±4.52*

表3 各組CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T 細(xì)胞分泌 TGF-β結(jié)果(mmol/L，)

表3 各組CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T 細(xì)胞分泌 TGF-β結(jié)果(mmol/L，)

注:與同組CD4+CD25-T細(xì)胞比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T細(xì)胞 混合細(xì)胞對(duì)照組 74.87 ±2.52＊＊ 14.27 ±2.35 8.32 ±3.58*GVHD 組 165.23 ±2.91＊＊ 18.27 ±3.72 11.69 ±4.57*無(wú) GVHD 組 205.09 ±2.83＊＊ 16.49 ±3.81 10.63 ±3.59*

表4 CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T 細(xì)胞分泌 IFN-γ結(jié)果(mmol/L，)

表4 CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T 細(xì)胞分泌 IFN-γ結(jié)果(mmol/L，)

注:與同組CD4+CD25-T細(xì)胞比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T細(xì)胞 混合細(xì)胞對(duì)照組 7 7.68 ±3.26＊＊ 46.72 ±6.23 25.73 ±5.66*GVHD 組 16 9.43 ±3.18＊＊ 52.46 ±8.59 26.54 ±6.78*無(wú) GVHD 組 2012.45 ±4.16＊＊ 61.26 ±7.48 34.86 ±5.75*

CD4+CD25+Tregs功能特征性標(biāo)志為無(wú)反應(yīng)性和抑制功能［2］，即 CD4+CD25+Tregs在體外對(duì)TCR激活或促有絲分裂抗體刺激下不增殖;而且在與CD4+CD25-T細(xì)胞的混合培養(yǎng)中，可以抑制后者產(chǎn)生IL-2基因的轉(zhuǎn)錄，可以抑制后者的增殖和分泌細(xì)胞因子。CD4+CD25+Tregs需通過(guò)其TCR被激活，一旦激活，其抑制功能是非特異性的［3］。CD4+CD25+Tregs還可把其抑制功能傳染給傳統(tǒng)的CD4+T細(xì)胞，成為傳染性耐受，這種傳染性耐受是細(xì)胞接觸依賴性，由 TGF-β 部分調(diào)節(jié)［4］。

為了檢測(cè)Allo-PBSCT受者外周血CD4+CD25+Tregs的體外功能，我們做了離體CD4+CD25+Tregs的無(wú)反應(yīng)性和抑制實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)有無(wú)GVHD移植受者的外周血CD4+CD25+體外在可溶性抗CD3-mAbs和抗CD28-mAbs的刺激下，均不增殖，表現(xiàn)出其無(wú)反應(yīng)性。而且在與CD4+CD25-T細(xì)胞的混合培養(yǎng)中均可抑制CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖和分泌細(xì)胞因子，表現(xiàn)出其抑制功能。這些均與正常對(duì)照組外周血CD4+CD25+Tregs的功能類似，與Beyer等［5］的研究結(jié)果相同。說(shuō)明有無(wú)GVHD移植受者的外周血CD4+CD25+Tregs仍保持了正常CD4+CD25+Tregs的功能，是真正的免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

本研究中，由于造血干細(xì)胞在受者骨髓植活，受者造血功能恢復(fù)，故CD4+CD25+Treg極有可能在受者骨髓中大量產(chǎn)生。其來(lái)源可能有二:一是供者的Tregs增殖，二是供者來(lái)源的非 Tregs轉(zhuǎn)化而來(lái)［6］。這些CD4+CD25+Treg保持正常免疫調(diào)節(jié)功能就可以抑制移植物中激活的T細(xì)胞，避免其對(duì)受者組織的攻擊，從而預(yù)防GVHD的發(fā)生。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) Allo-PBSCT受者外周血CD4+CD25+Tregs具有與健康人CD4+CD25+Tregs類似的無(wú)反應(yīng)性和抑制能力，說(shuō)明有無(wú)GVHD移植受者的外周血CD4+CD25+Tregs仍保持了正常CD4+CD25+Tregs的體外功能，是真正的免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。如果能有效地利用Allo-PBSCT受者外周血CD4+CD25+Tregs的抑制功能，則有可能降低Allo-PBSCT后GVHD的發(fā)病率。

［1］Adeegbe D，Bayer AL，Levy RB，et al.Cutting edge:allogeneic CD4+CD25+FOXP3+T regulatory cells suppress autoimmunity while establishing transplantation tolerance［J］.J Immunol，2006，176(12):7149-7153.

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［3］Thornton AM，Shevach EM.Suppressor effector function of CD4+CD25+immunoregulatory T cells is antigen nonspecific［J］.J Immunol，2000，164(1):183-190.

［4］Jonuleit H，Schmitt.The regulatory T family:distinct subsets and their interrelations［J］.J Immunol.，2003，171(12):6323-6327.

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