楊 力，姜勝華，胡彩華，徐瑞容，丁潤生，尤學芬，秦 燕，劉 紅

(南通大學附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001)

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組異質(zhì)性造血干細胞克隆性疾病，其主要特征為無效造血所致的難治性血細胞減少、骨髓病態(tài)造血和具有發(fā)展成急性白血病的高危傾向。由于細胞增殖和分化異常，骨髓細胞表面標志常異常表達，免疫表型、基因表達多有異常。近年來，我們分析了50例MDS免疫表型，并檢測其SURVIVIN、P15INK4B、TRF1基因mRNA表達情況?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2006年12月～2011年2月我院住院及門診患者50例，均根據(jù)WHO 1997標準診斷并分型，男28例、女22例，年齡21～83歲、中位年齡63歲。其中，難治性貧血(RA)23例，RA伴有環(huán)狀鐵幼粒細胞4例，RA伴多系發(fā)育異常11例，RA伴原始細胞增多12例。根據(jù)IPSS分期，50例患者中，低危25例，中危10例，高危15例。對照組30例，男17例、女13例，年齡26～76歲、中位年齡55歲;為正常體檢者、再生障礙性貧血以及特發(fā)性血小板減少性紫癜患者。

1.2 方法

1.2.1 細胞表面標記檢測 抽取MDS治療前患者和對照組骨髓 1～2 ml，EDTA-K2抗凝。采用CD45/SSC雙參數(shù)散點圖設(shè)門識別幼稚細胞群、成熟粒細胞群和成熟單核細胞群。采用美國BD公司流式細胞儀測定不同細胞群的分化抗原表達情況。標準單克隆抗體包括藻紅蛋白、異巰氰酸熒光素標記的 CD34、CD7、CD13、CD33 、CD11b、CD117 及同型對照等均購自美國BD公司。磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2 ～7.4)稀釋后調(diào)節(jié)細胞濃度至(2 ～5)×107/ml，室溫下進行單克隆抗體標記。各試管內(nèi)先加入不同單克隆抗體組合，再加入100 μl調(diào)整濃度后的單細胞懸液，充分混勻。然后加入2 ml紅細胞裂解液，離心(1500 r/min)5 min，去上清，PBS洗滌1次，PBS固定上機檢測。每次檢測各種熒光素均設(shè)定相應抗體的同型陰性對照。

1.2.2 細胞RNA抽取及RT-PCR 收集骨髓單個核細胞提取RNA(Trizol法提取)，在紫外分光光度計下測定RNA的OD值(OD值在1.6～2.0時可進行下一步實驗)，調(diào)節(jié) RNA濃度為1 μg/μl備用。RT-PCR 步驟采用兩步法，反應體系 RNA 5 μg、0.5 μg/μl Oligo(dT)1 μl、5 × reactiong buffer 4 μl、RNase inhibitor(20 U/μl)1 μl，dNTP mix(10 mmol/L)2 μl 和 RevertAidTMM-Mulv reverse transcriptase(200 U/μl)1 μl，總體積 20 μl。PCR 體系包括 cDNA 2 μl，上下游引物(10 pmol/μl)各 2 μl，dNTP mix(10 mmol/L)0.8 μl，10 × Taq buffer 5 μl，Taq酶(25 U/μl)0.5 μl和 MgCl2(25 mmol/L)。反應條件:β-actin mRNA(591 bp)上游引物 5＇-AAGTACTCC GTGTGGATCG G-3＇，下 游 引 物 5＇-ATCCTATC ACC TCCCCTGTG-3＇;94 ℃預變性 5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延40 s，共計22次循環(huán)，最終72℃延伸5 min。SURVIVIN mRNA(309 bp)上游引物 5＇-CTTTCTCAAGGACCACCGCATC-3＇，下游引物 5＇-CAATCCATGGCAGCCAGCTGC-3＇;擴增條件為94℃變性2 min后，94℃ 45 s，61℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán) 40次。P15INK4B mRNA(450 bp)上游引物 5＇-TGGGGGCGGCAGCGATGAG-3＇，下游引物 5＇-AGGTGGGTGGGGGTGGGAAAT-3＇;94℃ 預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共計30次循環(huán)，最終72℃延伸5 min。TRF1 mRNA(499 bp)上游引物 5＇-CCTCAGACAGCGAAGACTGA-3＇，下游引物 5＇-GCCTGTAATCCGAGCTACTCA-3＇;首先94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共擴增35個循環(huán)，最后72℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物5 μl，與DNA marker在1.8%瓊脂糖凝膠上電泳分離，電壓100 V，電流60 mA。30 min后將凝膠置于四星圖像分析儀中攝像，PCR條帶的密度采用Scion image圖像分析軟件半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 用Stata 7.0軟件，計量資料以表示，行單因素和兩因素方差分析以及方差齊性檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MDS患者骨髓細胞免疫表型 與對照組相比，MDS患者骨髓細胞原始群 CD45表達下降，CD34表達增多;粒細胞群CD34表達增多，CD13、CD33、CD11b表達下降，單核細胞表達 CD117和CD34。見表1。

2.2 SURVIVIN、P15INK4B、TRF1基因mRNA表達 與對照組相比，MDS患者骨髓單個核細胞SURVIVIN和 TRF1基因 mRNA表達增加，P15INK4B基因mRNA表達下降(P均＜0.05)。從低危組到高危組，SURVIVIN基因和TRF1基因mRNA表達增加，P15INK4B基因表達下降(P均＜0.05)。見圖1 ～3。

表1 MDS患者和對照組骨髓細胞各抗原表達(%，)

表1 MDS患者和對照組骨髓細胞各抗原表達(%，)

注:與對照組相比，*P ＜0.05

組別 n 原始細胞群CD7 CD34粒細胞群CD13 CD33 CD11b CD34單核細胞群CD117 CD34對照組 30 0.9 ±0.5 1.0 ±1.2 24.2 ±2.1 15.3 ±2.6 80.2 ±3.4 1.2 ±0.7 4.3 ±1.5 4.1 ±2.1 MDS 50 3.2 ±1.6* 9.6 ±2.5* 17.0 ±2.9* 11.2 ±1.4* 56.2 ±2.4* 11.3 ±1.1* 1.2 ±2.1* 0.9 ±0.9*

3 討論

圖1 SURVIVIN mRNA表達

圖2 TRF1 mRNA表達

圖3 P15INK4B mRNA表達

大量研究表明，多參數(shù)流式細胞術(shù)有助于MDS診斷和預后評價［1］。我們研究發(fā)現(xiàn)MDS患者原始細胞群CD7和CD34高表達;粒細胞群CD34表達增多，CD13、CD33、CD11b表達下降;單核細胞表達CD117和 CD34。Ogata等［2］研究發(fā)現(xiàn)，CD7 在高危MDS中通常陽性，表達隨MDS進展而增加，提示臨床預后差，可以作為MDS不良預后相關(guān)的獨立因素。原始細胞群高表達CD34，對MDS診斷有特征性［3］，表達水平與疾病進展明顯相關(guān)，表達增高者預后較差，易轉(zhuǎn)化為白血病，生存期短。粒細胞群CD34表達增多，CD13、CD33、CD11b表達下降，提示細胞成熟障礙。Ogata等［4］發(fā)現(xiàn)MDS粒細胞群的趨化、游走、黏附及吞噬功能減弱，臨床表現(xiàn)為病態(tài)造血嚴重，常常出現(xiàn)感染。CD117即干細胞生長因子受體，其表達隨著向終末成熟血細胞分化而逐漸下降，單核細胞發(fā)育早期即失去表達CD117。MDS患者單核細胞CD117表達可增高，CD117表達率和疾病進展有關(guān)，與其他免疫表型異常相比，CD117表達增高對于診斷MDS的特異性較高。同樣單核細胞發(fā)育早期也失去表達CD34，CD34表達也是MDS診斷的特異指標［5］。

SURVIVIN是近來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAP)家族成員，它不僅具有抑制細胞凋亡的功能，而且參與了細胞增殖分化的調(diào)控，與一些腫瘤的預后相關(guān)，并且和MDS發(fā)病進展密切相關(guān)。其中SURVIVIN通過與CDK4相互作用形成SURVIVIN/CDK4復合體，使CDK2/cyclinE激活、Rb磷酸化，導致p21從其與CDK4的復合體中釋放出來，并與線粒體的procaspase-3作用以抑制Fas介導的凋亡。蔡真等［6］發(fā)現(xiàn)，MDS患者SURVIVIN mRNA總陽性率高于正常對照組，高危組陽性率高于低危組，即隨著MDS的進展，SURVIVIN mRNA的表達率隨之增高。我們研究也同樣證實，與對照組相比SURVIVIN基因在MDS患者中高表達，且與預后有關(guān)。

P15INK4B基因產(chǎn)物被認為是細胞周期蛋白DCDK4/6復合物的抑制物，細胞周期蛋白D-CDK4/6復合物可磷酸化視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(RB蛋白)而導致轉(zhuǎn)錄因子的釋放，啟動細胞通過G1期限制點由G0期或G1期進入S期。P15INK4B表達增強，在MDS負向調(diào)節(jié)造血細胞增生和阻止其惡性轉(zhuǎn)換、促進分化中起重要作用［7］。本研究也證實P15INK4B基因在MDS患者中低表達，且和MDS預后分級相關(guān)。TRF1是第1個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物的端粒相關(guān)蛋白，它與端粒雙鏈DNA結(jié)合，改變端粒的結(jié)構(gòu)，阻止端粒酶與端粒的結(jié)合，從而阻止端粒的延長。MDS患者端粒長度縮短與IPSS危險度分層有顯著相關(guān)性，端粒長度縮短組的MDS患者有更低的血紅蛋白濃度，更差的細胞遺傳學改變和預后。TRF1作為端粒長度的負性調(diào)節(jié)因子，是揭示MDS預后不良的因素之一［8］。我們研究結(jié)果也同樣證實了這一點。

MDS早期常很難診斷，不易和再生障礙性貧血、免疫相關(guān)性全血細胞減少等疾病鑒別。和國內(nèi)外其他研究一樣，我們研究發(fā)現(xiàn)MDS細胞免疫分型有其特征性，且有基因的異常表達，此可能成為MDS輔助診斷的指標之一。

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