劉馨蓮，李淑蓉，殷 舞，孫 靜

(1成都醫(yī)學(xué)院，成都 610083;2廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院)

細(xì)胞增殖調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，DNA復(fù)制起始調(diào)控在細(xì)胞增殖調(diào)控中占核心地位。2007年8月～2009年4月，我們采用免疫組化法檢測腦膠質(zhì)瘤組織中微小染色體維持蛋白5(MCM5)［1，2］、細(xì)胞增殖相關(guān)核蛋白(Ki-67)的表達(dá)，旨在進(jìn)一步探討腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織44份(腫瘤組)，男25例，女19例;年齡4～73歲，平均36.8歲。術(shù)后均經(jīng)病理確診，且術(shù)前未行放化療。根據(jù)2000年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ級8例，Ⅱ級12例，Ⅲ級11例，Ⅳ級13例。另選同期因顱腦損傷行顱內(nèi)減壓術(shù)手術(shù)切除的正常腦組織6份(正常組)，兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異。主要試劑:MCM5單克隆抗體(Neomakers Fremont公司)，鼠抗人Ki-67單克隆抗體與SP試劑盒(北京中杉生物試劑公司)，DAB試劑盒(福州邁新公司)。

1.2 MCM5、Ki-67表達(dá)檢測 采用免疫組化 SP法。全部標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，普通石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，DAB顯色。石蠟切片脫蠟水化后，微波抗原修復(fù)，過氧化酶阻斷劑滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，羊血清工作液封閉，滴加一抗4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗，滴加鏈親和素一過氧化物酶溶液。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。用已知陽性組織切片為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):MCM5和Ki-67的陽性細(xì)胞均為細(xì)胞核呈棕黃色。計算MCM5和Ki-67的標(biāo)記指數(shù)(LI):選取10個陽性細(xì)胞最密集、背景最清晰區(qū)域，每個區(qū)域高倍視野下計算100個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計算1000個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。所有數(shù)據(jù)以表示，兩均數(shù)比較用t檢驗，相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析法。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MCM5、Ki-67表達(dá) 腫瘤組、正常組MCM5的LI分別為 12.96 ±8.49、0，P ＜0.05;Ki-67 的 LI分別為 10.09 ±7.07、0，P ＜0.05。

2.2 MCM5、Ki-67表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 MCM5、Ki-67的LI與腦膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系(LI，)

表1 MCM5、Ki-67的LI與腦膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系(LI，)

臨床病理特征 n MCM5 Ki67 P值性別男25 12.94 ±7.96 10.15 ±6.78 ＞0.05女19 13.00 ±9.37 10.00 ±7.62年齡(歲)＜40 22 7.87 ±5.14 5.70 ±3.60 ＞0.05≥40 22 18.06 ±8.18 14.47 ±7.01惡性程度Ⅰ級 8 3.70 ±1.53 3.11 ±1.41Ⅱ級 12 9.17 ±3.15 6.76 ±2.59 ＜0.05Ⅲ級 11 15.49 ±7.41 12.23 ±6.68Ⅳ級13 20.03 ±8.40 15.64 ±7.31

2.3 相關(guān)性分析 腦膠質(zhì)瘤組織中MCM5與Ki-67 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.990，P ＜0.01)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期密切相關(guān)，而細(xì)胞周期又與DNA復(fù)制的起始調(diào)控相關(guān)。微小染色體維持蛋白家族是一組與DNA復(fù)制和細(xì)胞增生密切相關(guān)的蛋白家族［1］。目前證實MCM家族由MCM2、MCM3、MCM4(Cdc21)、MCM5(Cdc46)、MCM6(Mis5)和MCM7(Cdc47)6個亞單位組成，具有解鏈酶活性［3］，是真核生物DNA復(fù)制的主要調(diào)控因子。MCM蛋白與細(xì)胞周期密切相關(guān)，是啟動真核細(xì)胞DNA復(fù)制，調(diào)控細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵蛋白［4］。在細(xì)胞周期中，MCM蛋白的表達(dá)在G1/S期達(dá)到峰值，細(xì)胞進(jìn)入G0期和分化衰老時，MCM表達(dá)水平下降甚至不能測得，此特點使其成為反映細(xì)胞增殖活性的特異指標(biāo)。Osaki等［5］研究表明，MCM蛋白能夠敏感而特異的反映細(xì)胞的增殖情況，在判斷腫瘤的惡性程度和評估預(yù)后方面具有重要意義。MCM5是MCM家族成員之一，其在靜止期的細(xì)胞中很少表達(dá)，在腫瘤組織細(xì)胞中大量表達(dá)，MCM5蛋白表達(dá)陽性是細(xì)胞具有增殖能力的標(biāo)志，可作為腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)志［6］。

Ki-67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，存在于細(xì)胞周期的G1后期、S期、G2期和M期，是目前應(yīng)用最為廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)記之一［7］。研究顯示，Ki-67并非細(xì)胞增殖所必需的因子，其G1早期并無表達(dá)，而是在核糖體生物合成過程中發(fā)揮作用［8］，且Ki-67表達(dá)易受細(xì)胞外因素影響(如細(xì)胞的營養(yǎng)狀態(tài))。因此，Ki-67可能僅能鑒定部分增殖細(xì)胞［9］。

本研究結(jié)果顯示，腫瘤組MCM5、Ki-67的LI明顯高于對照組，提示MCM5和Ki-67對區(qū)分正常腦組織和腦膠質(zhì)瘤組織有一定參考價值;MCM5、Ki-67陽性表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤惡性程度密切相關(guān)，且隨惡性程度升高而升高，說明隨著腫瘤惡性程度的增加，有越來越多的細(xì)胞進(jìn)入了增殖周期?？梢奙CM5和Ki-67蛋白表達(dá)水平可直接反映細(xì)胞的增殖活性。腫瘤組MCM5與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)，提示MCM5和Ki-67在標(biāo)記具有增殖活性的腫瘤細(xì)胞中具有相同的意義;在各級腫瘤中MCM5的表達(dá)均高于Ki-67的表達(dá)，原因可能是處于G1早期的細(xì)胞無Ki-67的表達(dá)，而MCM5的表達(dá)在G1/S期達(dá)到峰值，說明MCM5不但能夠檢測增生活躍的細(xì)胞，還能檢測具有增生潛能的細(xì)胞［1］，MCM5是一種更為靈敏的增殖標(biāo)志。

綜上所述，MCM5、Ki-67高表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。MCM5表達(dá)能更好的反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

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