李文媛，王 瑩，李明秋

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤，占耳鼻咽喉科惡性腫瘤的7.9% ～35.0%。血管內(nèi)皮生長因子受體-3(VEGFR-3)是淋巴管生成因子VEGF-C和VEGFD的特異性受體，不僅能促進淋巴管生長，還能充分保護淋巴管內(nèi)皮細胞，避免其凋亡，并誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞增殖和遷移［1］。2004年1月～2009年3月，我們分別檢測了VEGFR-3蛋白、VEGFR-3 mRNA的表達，旨在為喉癌的診治研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科手術(shù)切除的原發(fā)性喉癌組織標(biāo)本45份(喉癌組)，患者男43例，女2例;年齡41～86歲，中位年齡63.5歲;年齡≤60歲18例，＞60歲27例。均經(jīng)病理證實，無遠處轉(zhuǎn)移，術(shù)前均未接受化療、放療及其他抗癌治療;其中聲門型23例，聲門上型17例，聲門下型5例;腫瘤分化程度高分化29例，中分化12例，低分化4例;TNM分期為Ⅰ、Ⅱ期14例，Ⅲ、Ⅳ期31例。有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例;有淋巴管浸潤8例。另選20份正常喉良性病變組織標(biāo)本(良性組)作為對照。兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異。試劑:兔抗人VEGFR-3多克隆抗體及SP試劑盒，抗β-actin抗體，Trizol試劑、SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs，TaqDNA 聚合酶、DL2000DNA 標(biāo)志物，VEGFR-3引物。

1.2 VEGFR-3表達檢測 ①VEGFR-3蛋白:所有標(biāo)本均經(jīng)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.5%過氧化氫孵育10 min;PBS漂洗3次，正常山羊血清37℃孵育15 min后滴加稀釋后的一抗VEGFR-3(1∶100)。4℃過夜。滴加生物素標(biāo)記體，30 min，37℃。滴加過氧化物—鏈霉素卵白素37℃，30 min。DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染。以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片。隨機選取5個高倍視野按陽性細胞比例及著色程度計分，行半定量分析。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):VEGFR-3表達陽性為棕黃色，位于細胞膜或細胞質(zhì)。無著色細胞計為0分，著色細胞比例≤1/3計為1分，1/3～2/3計為2分，＞2/3計為3分。淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。兩項乘積判斷陽性結(jié)果，兩項乘積≤3分為陰性，＞3分計為陽性。②VEGFR-3 mRNA:取各項新鮮組織50 mg(喉癌組及良性組各6例)，采用Trizol法提取總RNA并行純度鑒定。以O(shè)LIGO六聚體為逆轉(zhuǎn)錄引物，以提取的總RNA為模板，在AMV催化下反轉(zhuǎn)錄出cDNA，實時熒光定量PCR法測定VEGFR-3的相對表達量。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)定量曲線對PCR產(chǎn)物定量分析，通過2ΔΔCt方法進行相對定量，分析VEGFR-3表達與喉癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.3 VEGFR-3表達與喉癌預(yù)后的關(guān)系 生存資料通過信訪或電話獲得，生存期開始時間自手術(shù)日期始，至2009年6月1日止，其中2例失訪。生存期計算以月為單位，未滿整月以實際生存天數(shù)計算。隨訪期限為3～71個月，中位31月。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，死亡病例均由復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移引起。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用 χ2檢驗，VEGFR-3 mRNA比較采用 t檢驗，生存曲線差異性采用Log-rank法檢驗。檢驗水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 VEGFR-3表達 喉癌組及良性組 VEGFR-3蛋白陽性率分別為 44.4%、15.0%，P ＜0.01。喉癌組及良性組VEGFR-3 mRNA相對表達量分別為10.4 ±2.7、2.3 ±0.6，兩組比較 P ＜0.01。VEGFR-3表達與喉癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。

表1 VEGFR-3表達與喉癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2 VEGFR-3表達與喉癌患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果提示，VEGFR-3陽性表達者平均生存時間為50個月，陰性表達者平均生存時間為60個月，Log-rank檢驗表明VEGFR-3陽性表達與生存曲線不相關(guān)(P=0.445)。

3 討論

在成體組織中VEGFR-3幾乎只特異表達于淋巴管內(nèi)皮細胞上。Stacker等［2］在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，VEGF-C和VEGF-D可以與VEGFR-3結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤組織周圍的淋巴管擴張和腫瘤內(nèi)部形成新生淋巴管。表達可溶性VEGFR-3-lg融合蛋白可以阻斷此信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤相關(guān)的淋巴管生成。研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌中，VEGFR-3表達與腫瘤組織淋巴管增加、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組 VEGFR-3、VEGFR-3 mRNA表達均顯著高于良性組，提示VEGFR-3可能在喉癌的發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。本文還發(fā)現(xiàn)，喉癌組VEGFR-3表達與喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管浸潤顯著相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、TNM分期無相關(guān)性，我們推測VEGFR-3在喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤過程中發(fā)揮重要作用。

目前，關(guān)于VEGFR-3對腫瘤預(yù)后影響的報道尚不多見，且爭議較多。Juttner等［4］報道胃癌的3年生存率與VEGFR-3表達有關(guān)，VEGFR-3是胃癌獨立的預(yù)后不良因素;研究認為，VEGFR-3表達程度

與肺癌的預(yù)后無關(guān)［5］。Baek等［6］認為高淋巴管密度(LVD)是喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的預(yù)后因子，而Hinojar-Gutiérrez等［7］則認為低 LVD 是獨立的喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)后因素。研究結(jié)果顯示，VEGFR-3陽性表達與喉癌患者的生存曲線無明顯相關(guān)性。因VEGFR-3主要局限于淋巴管內(nèi)皮細胞表達，是淋巴管內(nèi)皮細胞特異的分子標(biāo)志物，可以用于檢測LVD，所以我們認為LVD不能獨立作為喉癌整體生存率的預(yù)后因子。但此研究僅是針對一組有限喉癌患者數(shù)量的回顧性研究，結(jié)論仍需進一步證實。

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