朱 華，鄒登峰，沈 潔，張可峰，張小玲，朱 林

(1廣西中醫(yī)學院，南寧 530022;2桂林醫(yī)學院)

金花茶是一種具有極高藥用價值的天然中草藥，民間稱其“神茶”。2009年5月～2010年11月，我們觀察了金花茶醇提物對人低分化鼻咽癌CNE-2細胞增殖和周期的影響，旨在為進一步研究金花茶抑制腫瘤細胞生長的機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人低分化鼻咽癌細胞株CNE-2細胞(桂林醫(yī)學院科學實驗中心所提供);金花茶醇提物(桂林醫(yī)學院藥學院提取，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基逐級對倍稀釋成各種實驗所需濃度);DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國);小牛血清(杭州四季青生物制品廠);胰蛋白酶(Sigma公司);甲基偶氮唑鹽(Amresco公司，美國);Hoechst33342熒光染料(凱基生物工程材料有限公司);其余試劑為進口或國產分析純。SW-CJ-2FD超凈工作臺，CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司，美國)，倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡(Olympus公司，日本);平板離心機，96孔培養(yǎng)板(Deta公司，美國)，F(xiàn)ACScan型流式細胞儀(Becton Dickinson公司，美國)，普通及超低溫冰箱、電熱恒溫干燥箱、微量移液器等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人低分化鼻咽癌細胞株CNE-2細胞接種于含10%滅活小牛血清，含青霉素、鏈霉素各100 U/ml的DMEM培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)用50 ml培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2飽和濕度下的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 金花茶醇提物干預及細胞增殖抑制率檢測采用MTT法。取對數(shù)生長期的CNE-2細胞接種于96孔培養(yǎng)板，調整細胞密度為4×103/ml，每組設3個平行孔，24 h待細胞貼壁后，實驗組加入終濃度為 25、50、100、200、400 μg/ml的金花茶醇提物孵育，每孔200 μl，實驗中同時設陰性對照組(不加藥物的細胞懸液)和空白調零組(含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基)。藥物作用24、48、72 h后加入20 μl(5 mg/ml)的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩均勻 5 min，在酶標儀上測490 nm的吸光度(OD)值，計算細胞增殖抑制率及IC50。細胞增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.2.3 金花茶醇提物干預及細胞形態(tài)觀察 六孔板內每孔接種4×104個CNE-2細胞，24 h細胞貼壁后，分成實驗組和對照組，每組均設3個復孔，作用48 h后用倒置相差顯微鏡觀察并照相記錄實驗組和對照組細胞的形態(tài)變化。同時，采用多聚甲醛室溫固定，Hoechst 33342染色，熒光顯微鏡觀察照相。

1.2.4 金花茶醇提物干預及細胞周期及凋亡率檢測 取對數(shù)生長期細胞，每孔4×104個CNE-2細胞接種于六孔板中。培養(yǎng)24 h后細胞貼壁，實驗組加入 50、100、200 μg/ml的金花茶醇提物，對照組不加藥物。收集培養(yǎng)細胞，75%乙醇(4℃預冷)固定細胞過夜后送檢。樣本上機前將乙醇固定的細胞離心洗滌，加RNA酶(終濃度為0.5 g/L)，37℃水浴30 min，加碘化丙啶終濃度為1 g/L，振蕩混勻，30 min后上機檢測，進行細胞周期及凋亡率分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以表示，各組間均數(shù)差異比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制率 見表1。由表1可見，隨金花茶醇濃度增加，增殖抑制率逐漸升高，呈劑量依賴性。

2.2 細胞形態(tài) ①倒置相差顯微鏡下觀察:鏡下見陰性對照組細胞呈延展、扁平貼壁生長，細胞清晰，細胞均質而透明，核膜、核仁輪廓明顯，細胞間結構緊密，生長旺盛。而經過48 h藥物處理后，50 μg/ml組的細胞形態(tài)變化不明顯，增殖受到抑制，生長緩慢，幾乎停滯。100 μg/ml組可見部分細胞皺縮變小、變圓，細胞間接觸變松，逐漸由貼壁而脫落。200 μg/ml組可見大量細胞形態(tài)變圓、收縮、破碎，折光性差，脫落細胞懸浮于培養(yǎng)液中。根據(jù)圖示隨著濃度的升高，生長抑制越明顯。②熒光顯微鏡下觀察:陰性對照組CNE-2細胞核呈現(xiàn)彌散均勻的淡藍色熒光，核飽滿、大小均勻。50 μg/ml金花茶醇作用48 h后出現(xiàn)細胞凋亡，凋亡的細胞體變小，與周圍細胞分離，呈現(xiàn)致密濃染的強藍色熒光。藥物濃度升至100 μg/ml時，細胞骨架解體，核固縮，邊聚致密濃染的強藍色熒光。200 μg/ml作用后，出現(xiàn)了核裂解，核染色質聚集，呈現(xiàn)明顯細胞凋亡形態(tài)。隨著藥物濃度的升高，凋亡細胞也逐漸增多。

表1 實驗組不同時點細胞增殖抑制率(%)

2.3 細胞周期及凋亡率 見表2。由表2可見隨著藥物濃度的增加，G1期細胞比例增高，S期、G2期細胞比例降低，與對照組比較有顯著性差異，且呈劑量依賴性。隨著金花茶醇提物濃度的升高，細胞凋亡率亦逐漸增高。

表2 兩組細胞周期及凋亡率比較(%，)

表2 兩組細胞周期及凋亡率比較(%，)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 G1期 S期 G2期 凋亡率實驗組50 μg/ml 57.76 ±0.242△ 31.10 ±1.047*10.57 ±0.321*11.39 ±3.166100 μg/ml 60.27 ±0.608*29.70 ±0.736* 9.62 ±0.350*23.96 ±1.046200 μg/ml 64.20 ±0.901*27.31 ±0.662* 8.48 ±0.378*35.40 ±1.035對照組 55.44 ±1.258 34.93 ±0.288 11.59 ±0.205 1.15 ±0.500

3 討論

金花茶屬無毒級，金花茶葉含有多種氨基酸、茶多酚、皂甙類、黃酮類等人體所需的有益成分，且富含對人體有重要的保健作用的微量元素。其可改善因高血壓引起的各種不適癥狀及抗菌消炎、清熱解毒、利尿消腫、增強肝腎臟活力、防止血動脈硬化，防癌抑制腫瘤生長等［1～3］。金花茶葉子在民間被用于清熱解毒、利尿利濕、止痢和止血等，《本草綱目》對它的藥用價值有一定記載。研究證實，金花茶對肝癌細胞株BEL-7404、人宮頸癌HeLa S3細胞、人前列腺癌PC3細胞及人單核細胞白血病細胞株U937細胞均有不同程度的抑制生長的作用［4～6］。

細胞周期監(jiān)控機制的失控可發(fā)生在細胞增殖、損傷感應、DNA修復、細胞死亡等任何一個環(huán)節(jié)，從而引起細胞的基因組不穩(wěn)定［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，金花茶醇提物具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，且呈時間和劑量依賴性。倒置顯微鏡下觀察顯示隨著藥物濃度的增高，細胞變小皺縮，細胞間隙疏松，部分細胞懸浮。細胞周期是細胞分裂的完整體現(xiàn)，細胞周期的運轉是一個有序的基因調控過程(G1→S→G2→M)，這是細胞周期相關的基因在時間和空間上進行有序表達的結果，不能完成一個周期的細胞將進入程序化死亡或發(fā)生癌變。G1期監(jiān)測點功能的失活是腫瘤細胞的重要標志。本研究證實，金花茶醇提物可將細胞阻滯于G1期，影響細胞周期繼續(xù)轉變的過程，進而減少進入G2和S期的細胞數(shù)目，減少其有絲分裂;阻滯效果與藥物作用濃度呈正相關。

金花茶醇提物能夠抑制CNE-2細胞的增殖，其作用機制可能與誘導其G1期阻滯有關。

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