徐駿飛，江 穎，倪啟超，何志賢，汪 濤，徐 青，3*

(1南通大學(xué)附屬醫(yī)院，南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226001;2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院;3中國康復(fù)研究中心)

近年來，乳腺癌在我國的發(fā)病率和病死率迅速上升，已成為威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一。2009年12月～2010年9月，我們采用免疫組化En vision兩步法檢測了乳腺癌組織中叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXO3a)、β-連環(huán)素(β-Catenin)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)，旨在進(jìn)一步探討乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇我院手術(shù)切除的乳腺癌組織標(biāo)本68份(腫瘤組)，患者均為女性，年齡29～86歲，中位年齡48歲;年齡≤50歲45例，＞50歲23例。所有患者均經(jīng)病理證實(shí)，且術(shù)前均未行化療。按照2006年WHO乳腺腫瘤組織學(xué)分類Ⅰ級22例，Ⅱ級35例，Ⅲ級11例;腫瘤直徑≤2.0 cm 22例，＞2.0 cm 46例;腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性28例;雌激素受體(ER)陽性34例;PR陽性24例;HER2-～+33例，++～+++35例;采用國際抗癌協(xié)會(UICC)TNM分期法Ⅰ級15例，Ⅱ級35例，Ⅲ級18例;術(shù)后死亡12例(中位生存時間4年4月)。另選同期保存的20份乳腺纖維腺瘤組織標(biāo)本(腺瘤組)作對照，兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異。主要試劑:兔抗人FOXO3a(75D8)、兔抗人 β-Catenin(Cell Signal公司)，鼠抗人PCNA(PC10):sc-56(Santa Cruz公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Sigma 公司)，檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0，0.01 mol/L)及DAB顯色劑(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

1.2 FOXO3a、β-Catenin、PCNA 表達(dá)檢測 采用Envision兩步法。所有標(biāo)本均經(jīng)石蠟包埋，組織5 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，0.3%H2O2-甲醇溶液37℃ 30 min，檸檬酸緩沖液高壓抗原修復(fù)3 min，5%二抗正常血清室溫封閉2 h，一抗室溫孵育1 h后4℃過夜。FOXO3a、β-Catenin和 PCNA抗體的工作稀釋度均為1∶100，DAB顯色，蘇木精對比染色。采用已知的免疫組化染色陽性標(biāo)本作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷:光鏡下每張切片選取5個有代表性的高倍視野(×400)，每個視野隨機(jī)計數(shù)300個腫瘤細(xì)胞，共計1500個，計算陽性細(xì)胞百分率，按陽性細(xì)胞所占比例分級。FOXO3a和PCNA蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜10%為陰性，≥10%為陽性。β-Catenin表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，細(xì)胞膜呈棕褐色細(xì)小顆粒狀著色為陽性。根據(jù)文獻(xiàn)將染色計為0～3分。0分:細(xì)胞膜、質(zhì)均未染色“-”;1分:細(xì)胞質(zhì)染色為主“+”;2分:異質(zhì)性染色(細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核混合染色)“++”;3分:連續(xù)的細(xì)胞膜染色“+++”。0、1和2分者均為異常表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0、Stata7.0統(tǒng)計軟件。各組數(shù)據(jù)間比較采用χ2檢驗(yàn)，各指標(biāo)間相互關(guān)系比較用Spearman等級相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 FOXO3a、β-Catenin、PCNA 表達(dá) 腫瘤組、腺瘤組 FOXO3a陽性表達(dá)率分別為60%、90%，β-Catenin異常表達(dá)率分別為65%、25%，PCNA陽性表達(dá)率分別為69%、35%，P均＜0.05。

2.2 FOXO3a、β-Catenin、PCNA 表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 FOXO3a、β-Catenin、PCNA蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 相關(guān)性分析 乳腺癌組織中FOXO3a陽性表達(dá)與β-Catenin異常表達(dá)、PCNA陽性表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r分別為 -0.145、-0.173，P 均 ＜ 0.05)，β-Catenin異常表達(dá)與PCNA陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.04，P ＜0.05)。

3 討論

乳腺癌是發(fā)達(dá)國家中致死率較高的腫瘤性疾病，其發(fā)生發(fā)展是多基因多因素共同作用的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a是發(fā)育調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子叉頭基因家族中的一員，是PI3K-Akt信號通路中起關(guān)鍵作用的重要因素之一，其含有一個高度保守的DNA結(jié)構(gòu)域，由100個含有特征性α螺旋、β鏈及環(huán)1和C末端［1～3］保守的氨基酸殘基組成。其定位于6號染色體，并編碼673個氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a在細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化、分化、衰老等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用;在多種癌組織中表達(dá)［4］。Jin等［5］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a蛋白在乳腺腫瘤不同組織學(xué)類型中表達(dá)，良性腫瘤中絕大多數(shù)FOXO3a廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中，且處于非活性狀態(tài)。而在惡性乳腺中，大多數(shù)表達(dá)以活化形式存在于細(xì)胞核中。本研究腫瘤組FOXO3a陽性表達(dá)率明顯低于腺瘤組，提示FOXO3a的表達(dá)失活可能與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。FOXO3a陽性表達(dá)與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、臨床分期、預(yù)后相關(guān)，提示隨著乳腺癌的進(jìn)展，F(xiàn)OXO3a表達(dá)率降低。FOXO3a可能不僅與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)，且與乳腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)。

目前研究證明，癌基因的致癌作用及抑癌基因的抑癌作用是多個基因共同作用的結(jié)果。β-Catenin是一胞質(zhì)蛋白，除參與細(xì)胞間黏附過程中鈣黏著蛋白與細(xì)胞骨架的肌動蛋白黏附，在Wnt通路中發(fā)揮比較關(guān)鍵的作用。致癌的關(guān)鍵是β-Catenin降解障礙致使胞質(zhì)內(nèi)游離的β-Catenin聚集并與Tcf/Lef結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因CyclinD1、C-myc的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。正常乳腺組織中β-Catenin主要表達(dá)于細(xì)胞膜，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中幾乎不著色，而乳腺癌組織中則相反，主要在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)聚集表達(dá)［6，7］。本研究腫瘤組 β-Catenin 異常表達(dá)率明顯高于腺瘤組，提示β-Catenin的高表達(dá)在乳腺癌的發(fā)生中可能起重要作用。β-Catenin異常表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)，提示其高表達(dá)可能在乳腺癌的惡性程度和轉(zhuǎn)移性有密切關(guān)系。

PCNA 是瘤細(xì)胞增生活躍的指標(biāo)［8，9］，是判斷乳腺癌預(yù)后的有效標(biāo)記物。PCNA的表達(dá)與瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)，陽性表達(dá)者特別是陽性強(qiáng)度越高時預(yù)后較差。本研究腫瘤組PCNA陽性表達(dá)率明顯高于腺瘤組，提示PCNA在惡性組織中的表達(dá)明顯高于良性組織。PCNA陽性表達(dá)與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)，提示PCNA高表達(dá)增加了瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的危險性。本研究還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中FOXO3a陽性表達(dá)與β-Catenin異常表達(dá)、PCNA陽性表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，β-Catenin異常表達(dá)與PCNA陽性表達(dá)呈正相關(guān)。說明 β-Catenin、PCNA可能作為FOXO3a作用途徑中的相關(guān)基因，相互作用共同參與乳腺癌的發(fā)生過程。但FOXO3a與β-Catenin、PCNA基因的相互作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

［1］Tsai KL，Huang CY，Chang CH，et al.Crystal structure of the human FOXK1a-DNA complex and its implications on the diverse binding specificity of winged helix/fork head proteins［J］.J Biol Chem，2006，281(25):17400-17409.

［2］Stroud JC，Wu YM，Bates DL，et al.Structure of the forkhead domain of FOXP2 bound to DNA［J］.Structure，2006，14(1):159-166.

［3］Weigelt J，Climent I，Dahlman-Wright K，et al.Solution structure of the DNA binding domain of the human forkhead transcription factor AFX(FOXO4)［J］.Biochem，2001，40(20):5861-5869.

［4］Lau QC，Raja E，Salto-Tellez M，et al.RUNX3 is frequently inactivated by dual mechanisms of protein mislocalization and promoter hypermethylation in breast cancer［J］.Cancer Res，2006，66(13):6512-6520.

［5］Jin GS，Kondo E，Miyake T，et al.Expression and intracellular localization of FKHRL1 in mammary gland neoplasms［J］.Acta Med Okayama，2004，58(4):197-205.

［6］Morin PJ.Beta-Catenin signaling and cancer［J］.Bioessays，1999，21(12):1021-1030.

［7］Polakis P.Wnt signaling and cancer［J］.Genes Dev，2000，14(15):1837-1851.

［8］Torben H，Grete KJ，Karin Z.Correlation of growth fraction by Ki-67 and proliferatating cell nuclear antigen(PCNA)immunohistochemistry with histopathological parameters and prognosis in primary breast carcinomas［J］.Virchows Arch，1998，(433):223-228.

［9］劉君，方志沂，石松魁.保乳手術(shù)治療乳腺癌［J］.實(shí)用癌癥雜志，2003，18(4):403-405.