王 彥，賴克方*，張 巧，馬千里，王長征

(1呼吸疾病國家重點實驗室，廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，廣州呼吸疾病研究所，廣州 510120;2第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院全軍呼吸疾病研究所)

殼聚糖(CS)是天然多糖中惟一的陽離子堿性氨基多糖，生物相容性好，無毒，無抗原性，可生物降解，可包封帶負電荷高聚物藥物，是一種優(yōu)良的藥物載體，已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點［1］。CS納米粒的制備方法以離子凝膠法最常用，其原理是CS的氨基陽離子與三聚磷酸鈉(TPP)的磷酸基陰離子通過靜電吸引進行分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，并進一步凝膠化而形成納米顆粒，含有100 nm以上的納米粒則可見乳光，因此制備成功的納米微粒溶液呈乳光樣，一般為泛藍色，可作為評價CS 納米粒制備成功與否的標準之一。2009年8月～2010年7月，我們觀察了CS濃度、TPP濃度、CS/TPP質(zhì)量比和CS溶液pH值對CS納米粒乳光溶液制備，以及對CS納米粒粒徑和Zeta電位的影響。現(xiàn)報告并分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料 CS(脫乙酰度95%，分子量40萬，美國amerosco公司);TPP、冰醋酸(天津市大茂化學試劑廠);Zetasizer3000HS激光粒度儀及Zeta電位儀(英國Malvern公司);磁力攪拌器(德國IKA公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 CS納米粒制備 將CS溶解于1%醋酸溶液，調(diào)節(jié)pH值為4～6，TPP溶于超純水，調(diào)節(jié)pH值為7.2 ～7.7，用0.45 μm 濾膜過濾。持續(xù)磁力攪拌下(200～400 r/min)，取 CS溶液 8 ml，緩慢加入TPP溶液，保持攪拌20～30 min，以獲得CS納米粒。

1.2.2 CS納米粒乳光液體制備的影響因素觀察觀察以下因素影響下的液體性狀。①CS、TPP濃度:不同濃度CS溶液，調(diào)pH值為4.5，緩慢加入不同濃度TPP溶液。②CS溶液pH值:調(diào)節(jié)不同濃度CS溶液pH值分別為3.0～6.0，向不同pH值不同濃度CS溶液緩慢加入2.0 mg/ml TPP溶液。③CS/TPP質(zhì)量比:調(diào)節(jié)CS溶液pH值為4.8，向不同濃度CS溶液中緩慢加入2.0 mg/ml TPP溶液達到不同CS/TPP質(zhì)量比。

1.2.3 CS納米粒的粒徑和Zeta電位的影響因素觀察 制備CS納米粒的方法同1.2.1，觀察以下因素對CS納米粒粒徑和Zeta電位的影響。①CS濃度:向pH值為4.8的不同濃度CS溶液中緩慢加入2.0 mg/ml TPP至CS/TPP質(zhì)量比為6∶1。②CS溶液pH值:向不同pH值的1.0 mg/ml CS溶液中緩慢加入2.0 mg/ml TPP溶液使 CS/TPP質(zhì)量比為6∶1。③CS/TPP質(zhì)量比:調(diào)節(jié) CS溶液 pH 值為4.8，向1.0 mg/ml CS溶液中緩慢加入2.0 mg/ml TPP溶液使CS與TPP達到不同質(zhì)量比。采用激光粒度儀及Zeta電位儀測定以上條件下納米粒粒徑和Zeta電位。

2 結(jié)果

2.1 CS濃度和TPP濃度對液體性狀的的影響 見表1。由表1 可見，CS 濃度在0.5 ～3.0 mg/ml、TPP濃度在0.8～3.0 mg/ml易獲得CS納米乳光溶液，且CS濃度較TPP濃度對反應結(jié)果影響更顯著。當CS濃度≤0.2 mg/ml時，加入TPP即刻發(fā)生沉淀。CS濃度≥4.0 mg/ml，加入TPP不能產(chǎn)生乳光溶液。在合適 CS濃度(0.5～1.5 mg/ml)下，TPP濃度對CS納米乳光溶液制備影響小。

表1 不同濃度的CS溶液(pH 4.5)與TPP溶液對液體性狀的影響

2.2 CS溶液pH值對液體性狀的影響 見表2。由表2可見，CS溶液pH值為6.0時加入TPP即刻發(fā)生沉淀。pH值≤3.0時，CS與TPP無法形成乳光溶液。CS溶液 pH 值為3.5～5.0、CS濃度為0.5～2.5 mg/ml時，易獲得穩(wěn)定的乳光溶液。

表2 CS溶液pH值對液體性狀影響

2.3 CS/TPP質(zhì)量比對液體性狀的影響 見表3。由表3可見，CS/TPP質(zhì)量比為4∶1～12∶1時易產(chǎn)生乳光溶液。隨著 CS/TPP質(zhì)量比增大，CS濃度降低，溶液乳光程度逐漸降低。CS/TPP質(zhì)量比以6∶1～12∶1產(chǎn)生乳光溶液穩(wěn)定，靜置后不易產(chǎn)生沉淀。CS濃度≥1.5 mg/ml，CS/TPP 質(zhì)量比為 3∶1 ～5∶1時乳光溶液靜置后易產(chǎn)生沉淀，CS濃度越大沉淀越明顯。

表3 CS/TPP質(zhì)量比對液體性狀的影響

2.4 CS濃度對納米粒粒徑和Zeta電位的影響 見表4。由表4可見，隨著CS濃度的增加，CS納米粒粒徑和Zeta電位顯著增大。

表4 CS濃度對納米粒粒徑和Zeta電位的影響()

表4 CS濃度對納米粒粒徑和Zeta電位的影響()

CS濃度(mg/ml) 粒徑(nm) Zeta電位(mV)0.5 152.5 ±14.7 36.56 ±1.361.0 189.3 ±19.1 38.12 ±1.641.5 247.6 ±30.4 40.48 ±2.052.0 306.0 ±44.6 48.95 ±3.732.5 362.2 ±52.3 54.76 ±5.18

2.5 CS溶液pH值對納米粒粒徑和Zeta電位的影響 見表5。由表5可見，pH值降低導致CS納米粒Zeta電位增高。pH值對CS納米粒粒徑幾乎無影響，但pH值為5.5時粒徑突然顯著增大。

2.6 CS/TPP質(zhì)量比對納米粒粒徑及Zeta電位的影響 CS/TPP質(zhì)量比增高引起CS納米粒粒徑逐漸變小，但對Zeta電位影響復雜(見表6)。CS/TPP質(zhì)量比從6∶1降低至3∶1時，Zeta電位隨之明顯降低。

表5 CS溶液pH值對納米粒粒徑和Zeta電位的影響()

表5 CS溶液pH值對納米粒粒徑和Zeta電位的影響()

pH值 粒徑(nm) Zeta電位(mV)3.5 187.3 ±15.1 48.42 ±3.694.0 188.7 ±14.5 41.64 ±3.004.5 183.4 ±15.9 36.95 ±1.875.0 192.6 ±17.3 34.38 ±1.625.5 220.5 ±20.8 31.01 ±2.14

表6 CS/TPP質(zhì)量比對納米粒粒徑和Zeta電位的影響()

表6 CS/TPP質(zhì)量比對納米粒粒徑和Zeta電位的影響()

CS∶TPP 粒徑(nm) Zeta電位(mV)3∶1 226.2 ±27.6 31.35 ±1.214∶1 208.0 ±22.4 34.47 ±1.465∶1 194.1 ±21.0 36.12 ±1.636∶1 182.5 ±16.3 37.54 ±1.508∶1 165.8 ±13.5 38.06 ±1.8410∶1 150.7 ±11.2 38.43 ±2.25

3 討論

離子凝膠法制備CS納米粒簡單易行，TPP無毒，無需使用有機溶劑，但是受多種因素的影響。CS為堿性多糖，在酸性溶液中發(fā)生氨基質(zhì)子化是CS納米形成的關(guān)鍵［2］，因此CS-TPP反應結(jié)果與CS溶液pH值關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，CS溶液pH值以3.5 ～5.0為宜，這與吳振宇等［3］研究結(jié)果一致。CS溶液pH值為6.0時，加入TPP即刻發(fā)生沉淀，可能與CS溶解性降低和陽性電價發(fā)生改變有關(guān)，與CS濃度無關(guān)。而pH值≤3.0時，TPP的磷酸基團被氫離子占據(jù)，CS-TPP間的靜電吸引受影響，而無法形成乳光溶液。

CS和TPP溶液的濃度、CS/TPP質(zhì)量比對CS納米粒的制備影響亦非常顯著。CS濃度和TPP濃度過低導致離子強度太低，TPP的磷酸基與CS的氨基靜電吸引力較小，分子內(nèi)或分子間交聯(lián)弱，無法使溶液凝膠化而形成納米乳光溶液。CS和TPP濃度過高會因為離子強度太高無法得到CS納米粒。研究發(fā)現(xiàn)，CS濃度過高時(CS≥4.0 mg/ml)，CS溶液的離子強度高，CS氨基基團同性相斥促使CS分子彎曲聚集，加入TPP可促使CS進一步聚集而沉淀［4］。CS/TPP質(zhì)量比過低或過高則會因為氨基和磷酸基搭配比例不均無法形成納米粒。我們發(fā)現(xiàn)CS/TPP質(zhì)量比＜3∶1時出現(xiàn)沉淀，系磷酸基相對過多引起CS粒聚集所致。因此，CS濃度0.5～2.5 mg/ml，TPP 濃度為 0.8 ～ 3.0 mg/ml，CS/TPP 質(zhì)量比為6∶1～12∶1，可得到穩(wěn)定CS納米粒乳光溶液。

本文還發(fā)現(xiàn)，CS濃度的增加導致CS納米粒粒徑和 Zeta 電位顯著增大，與 Hu 等［5］、Grenha 等［6］研究結(jié)果一致。CS納米溶液的Zeta電位與氨基被中和程度有關(guān)，CS濃度越高，未被中和的氨基越多，Zeta電位越高，而且未中和的氨基會導致更強的分子內(nèi)交聯(lián)，促使CS分子彎曲聚集，導致納米粒粒徑增大。我們發(fā)現(xiàn)pH值降低導致CS納米粒Zeta電位增高，因為pH值越低，氨基越多。pH值對CS納米粒徑無顯著影響，但pH值為5.5時粒徑突然顯著增大，可能因為微弱的CS-TPP相互作用誘發(fā)廣泛的分子內(nèi)交聯(lián)導致粒徑突然增大。CS/TPP質(zhì)量比也是影響CS納米粒特征的重要因素。我們發(fā)現(xiàn)，CS/TPP質(zhì)量比降低，TPP相對量增多，剩余TPP促使單個納米粒交聯(lián)形成更大的納米粒，導致CS納米?？傮w粒徑增大，而且TPP相對量增多導致氨基總量相對減少，導致Zeta電位降低，此與國外研究結(jié)果一致［7］。

總之，離子凝膠法制備CS納米粒的主要影響因素為CS濃度、CS/TPP質(zhì)量比和CS溶液pH值，CS濃度和CS/TPP質(zhì)量比對CS納米粒粒徑影響顯著，CS濃度和CS溶液pH值對CS納米粒Zeta電位影響顯著。

［1］Rinaudo M.Chitin and chitosan:properties and applications［J］.Prog Polym Sci，2006，31(7):603-632.

［2］Sun Y，Wan AJ.Preparation of nanoparticles composed of chitosan and its derivatives as delivery systems for macromoecules［J］.J Appl Polym Sci，2007，105(2):552-561.

［3］吳振宇，陳鐘，黃華，等.離子凝膠法制備殼聚糖納米微粒［J］.南通大學學報(醫(yī)學版)，2005，25(1):20-22.

［4］Tsai ML，Bai SW，Chen RH.Cavitation effects versus stretch effects resulted in different size and polydispersity of ionotropic gelation chitosan-sodium tripolyphosphate nanoparticle［J］.Carbohydr Polym，2008，71(3):448-457.

［5］Hu B，Pan CL，Sun Y，et al.Optimization of fabrication parameters to produce chitosan-tripolyphosphate nanoparticles for delivery of tea catechins［J］.J Agric Food Chem，2008，56(16):7451-7458.

［6］Grenha A，Seijo B，Remunán-López C.Microencapsulated chitosan nanoparticles for lung protein delivery［J］.Eur J Pharm Sci，2005，25(4-5):427-437.

［7］Papadimitriou S，Bikiaris D，Avgoustakis K，et al.Chitosan nanoparticels loaded with dorzolamide and pramipexole［J］.Carbohydr Polym，2008，73(1):44-54.