張 麗，譚海波，孫 濤，傅志儉，于靈芝*

(1首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050;2山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院;3山東大學附屬省立醫(yī)院)

神經病理性疼痛是指由中樞或外周神經系統(tǒng)損傷或疾病引起的疼痛綜合征，通常在神經損傷正常愈合后仍持續(xù)存在。2009年10月～2010年6月，我們采用RT-PCR法測定了慢性坐骨神經擠壓性損傷(CCI)大鼠海馬組織中核因子-κB(NF-κB)mRNA、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA和神經元型一氧化氮合酶(nNOS)mRNA表達，旨在進一步探討神經病理性疼痛的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性 Wister大鼠70只，體質量220～280 g，由山東大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(Fermentas公司)，RT-PCR引物(上海生工生物工程公司合成)，von Frey絲(Stoelting公司，美國)，BME-410A熱痛刺激儀(中國科學院生物醫(yī)學工程公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備 將70只大鼠隨機分為實驗組及對照組各35只，實驗組采用Bennett等［1］方法制備神經病理性疼痛模型:大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，常規(guī)消毒右下肢，于股骨外側縱行切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經，接近分叉前游離出約7 mm神經，顯微鏡下4-0鉻制腸線松扎4處，間隔為1 mm(以不影響神經外膜的血運為原則)。結扎時見肢體輕微抽動即模型制備成功，逐層縫合，術后肌注青霉素8萬U，2次/d。對照組僅暴露坐骨神經干，不予結扎。

1.2.2 觀察項目 ①機械痛閾、熱痛閾:分別于術前1 d 及術后1、4、7、14、21、28 d 采用 von Frey絲以up-down法推算50%縮足反射閾值［2］，即機械痛閾值;BME-410A熱痛刺激儀測定足底部熱縮足反射潛伏期，即熱痛閾值［3］。②海馬組織NF-κB mRNA、iNOS mRNA、nNOS mRNA表達:測定機械痛閾和熱痛閾后于上述每個時間點處死大鼠5只，取海馬組織，將標本迅速入液氮保存。Trizol一步法提取組織總RNA。紫外分光光度計測定濃度和純度。取總RNA 2 μg用逆轉錄試劑盒合成cDNA，再行PCR擴增。RT-PCR引物由上海生工生物工程公司合成，擴增條件為50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。95 ℃ 15 s，60℃ 1 min，95 ℃15 s，60℃ 15 s。反應在 Applied Biosystems 7500 PCR儀上進行。為了控制樣本間mRNA質量的變異，同時檢測管家基因 GAPDH表達。結果采用SDS軟件進行2-ΔΔCT法相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，兩樣本均數(shù)比較采用成組設計的t檢驗，成組設計的多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 機械痛閾及熱痛閾值 見表1。

2.2 NF-κB mRNA、iNOS mRNA、nNOS mRNA 水平見表2。

3 討論

表1 兩組手術前后機械痛閾、熱痛閾比較(n=5，)

表1 兩組手術前后機械痛閾、熱痛閾比較(n=5，)

注:與術前1 d相比，*P ＜0.05;與對照組相比，△P ＜0.05

組別 術前1 d 術后1 d 術后4 d 術后7 d 術后14 d 術后21 d 術后28 d實驗組機械痛閾值(g) 28.6 ±3.2 16.9 ±2.3＊△ 14.1 ±1.9＊△ 10.6 ±2.5＊△ 12.6 ±2.2＊△ 15.6 ±2.1＊△ 17.6 ±2.6＊△熱痛閾值(s) 16.5 ±2.0 8.8 ±1.6＊△ 5.9 ±1.0＊△ 6.4 ±1.3＊△ 6.8 ±2.1＊△ 8.9 ±1.5＊△ 9.7 ±1.9＊△對照組機械痛閾值(g) 27.3 ±2.6 28.2 ±3.1 26.6 ±3.5 26.0 ±3.3 25.8 ±2.7 26.1 ±2.3 27.4 ±3.1熱痛閾值(s) 16.8 ±2.4 17.7 ±2.5 18.0 ±2.8 17.3 ±2.1 16.6 ±2.2 17.3 ±2.3 17.0 ±2.0

表2 兩組手術后海馬組織 NF-κB mRNA、iNOS mRNA、nNOS mRNA表達(n=5，)

表2 兩組手術后海馬組織 NF-κB mRNA、iNOS mRNA、nNOS mRNA表達(n=5，)

注:與對照組同時點相比，*P ＜0.05;與同組術后14 d相比，△P ＜0.01;與同組術后28 d相比，#P ＜0.01

組別 術后1 d 術后4 d 術后7 d 術后14 d 術后21 d 術后28 d實驗組NF-κB mRNA 1.050 ±0.578 1.640 ±0.064* 2.010 ±0.096＊△# 1.606 ±0.086* 1.529 ±0.064* 1.439 ±0.121*iNOS mRNA 1.166 ±0.133 1.500 ±0.176* 1.494 ±0.121* 1.583 ±0.132* 2.252 ±0.126＊△# 1.684 ±0.097*nNOS mRNA 1.153 ±0.137 1.098 ±0.109 1.308 ±0.121* 1.462 ±0.099* 1.995 ±0.117＊△# 1.502 ±0.108*對照組NF-κB mRNA 0.989 ±0.114 1.061 ±0.058 1.108 ±0.072 1.012 ±0.053 1.018 ±0.0562 1.004 ±0.134 iNOS mRNA 1.209 ±0.135 1.285 ±0.094 1.323 ±0.111 1.246 ±0.125 1.277 ±0.114 1.323 ±0.131 nNOS mRNA 1.003 ±0.079 1.057 ±0.129 1.078 ±0.084 1.045 ±0.111 1.049 ±0.128 1.022 ±0.118

神經病理性疼痛發(fā)病機制復雜，臨床治療效果欠佳。NF-κB是一種具有多向性轉錄激活功能的調節(jié)因子，可以調控編碼多種疼痛相關因子(NOS、TNF-α、IL-1 等)的表達［4］，參與神經病理性疼痛的發(fā)生和維持。NF-κB對細胞內許多基因尤其涉及炎癥和免疫反應的基因表達起著關鍵性的調控作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB對于海馬區(qū)的突觸傳導和維持長時程增強(LTP)、長時程抑制具有重要作用，且可能通過將神經突觸傳來的短時信號轉換為基因表達的長時改變而參與對記憶形成、神經塑型以及慢性疼痛的調控［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組及術前比較，實驗組NF-κB mRNA水平于術后4 d開始增加，7 d達到高峰，術后14、28 d仍維持于較高水平。該結果表明外周神經損傷可以激活海馬NF-κB，并且可以較長時間表達，從而參與對神經病理性疼痛的調控。

研究發(fā)現(xiàn)，NOS作為NO合成的限速酶參與了突觸可塑及慢性疼痛等病理生理過程。NO既是細胞間和細胞內重要的信使分子，也作為一種神經遞質參與神經病理性疼痛的調控［7］。由于NO是氣體，且半衰期非常短，很難直接準確測定NO含量，因此，在研究中一般測定NOS，以此間接反映NO的生成速度和量。NO的調節(jié)是一個復雜而緊密的過程，其表達受NOS活性的影響，NOS的調節(jié)主要是在轉錄和轉錄后水平。文獻報道，iNOS啟動子上存在NF-κB的結合位點，可以使NF-κB活化，與DNA上的特異位點(κB位點)結合，從而調控NO的表達［8］。而NO在海馬的學習記憶中有重要作用，其以一種逆向信息傳遞物質的形式參與海馬的LTP效應，而后者則是學習記憶的神經基礎和分子機制［9］。神經病理性疼痛大鼠可能正是通過海馬NOS表達的增加，合成更多的NO參與LTP，從而進一步影響學習、記憶和認知能力。本文發(fā)現(xiàn)，與對照組及術前比較，實驗組iNOS mRNA水平于術后4 d開始升高，nNOS mRNA水平于術后7 d開始升高，兩者均于21 d達到高峰，在28 d仍維持在較高水平。提示nNOS和iNOS mRNA表達時間的延遲可能不參與慢性疼痛的觸發(fā)和啟動，而與慢性疼痛的長期維持有關。本研究我們還發(fā)現(xiàn)，與對照組及術前比較，實驗組術后各時點術側機械痛閾及熱痛閾明顯降低。

總之，CCI術后大鼠海馬中 NF-κB及其下游nNOS、iNOS mRNA表達持續(xù)增加，可能與神經病理性疼痛的維持及其對認知能力的影響有關。

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