張 萌，袁乃芬，劉 巍

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)是兒童常見的眼內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅患兒的視力和生命。凋亡抑制蛋白(Livin)是2000年由科學(xué)家在人基因組庫中篩選克隆出的一種新型、有較強(qiáng)抗凋亡功能的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族新成員，能夠與凋亡蛋白酶結(jié)合，抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［1，2］。2000年1月 ～2010年12月，我們采用Max-VisionTM快捷免疫組化法檢測RB中Livin的表達(dá)情況，旨在進(jìn)一步了解其在RB發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇我院手術(shù)切除的RB組織標(biāo)本43份(腫瘤組)，其中男23例，女20例;年齡9個(gè)月～8歲，平均3.35歲。所有患兒均經(jīng)病理證實(shí)，且術(shù)前均未進(jìn)行放化療。按傳統(tǒng)臨床分期，眼內(nèi)生長期21例，青光眼期13例，眼外擴(kuò)展期9例;按照組織病理學(xué)分型，未分化型24例，分化型19例。另選外傷后眼球摘除的正常組織標(biāo)本6份(正常組)，兩組一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。主要試劑:兔抗人Livin多克隆抗體購自北京博奧森公司(bs-0738R)。主要儀器:Leica RM2135型切片機(jī)、Olympus BX41顯微鏡、Qcapture圖像采集系統(tǒng)(加拿大Qimaging公司)。

1.2 Livin表達(dá)檢測 所有標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，自動(dòng)脫水，浸蠟，包埋，切片。蘇木素—伊紅(HE)染色按常規(guī)進(jìn)行。免疫組化采用Max-VisionTM快捷免疫組化法。石蠟切片脫蠟和水化后，PBS(pH 7.4)沖洗3次，抗原修復(fù)后，3%過氧化氫室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性，PBS沖洗3次，加入工作濃度1∶300的Livin抗體室溫孵育2～3 h，PBS沖洗3次，加入二抗，室溫下孵育20 min，PBS沖洗，最后DAB顯色，中止反應(yīng)后蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。以已知的陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。陽性判定標(biāo)準(zhǔn):Livin表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒作為陽性結(jié)果判定。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不同高倍視野各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按陽性細(xì)胞所占的百分比計(jì)分:≤5%計(jì)0分，6% ～25%計(jì)1分，26% ～50%計(jì)2分，51% ～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分;著色強(qiáng)度依據(jù)著色計(jì)分:無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕褐色為3分。上述兩項(xiàng)相加＜2分為陰性，＞2分為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Livin表達(dá)情況 兩組Livin陽性表達(dá)率分別為62.79%、0，P ＜0.05。

2.2 Livin表達(dá)與RB臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 Livin表達(dá)與RB臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生不僅與癌基因的激活和抑癌基因的突變或缺失有關(guān)，還與腫瘤凋亡的抑制有關(guān)。凋亡抑制是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特性，與腫瘤細(xì)胞無限增殖密切相關(guān)。IAPs是目前發(fā)現(xiàn)的惟一可以與半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)直接結(jié)合而起抑制作用的蛋白家族，其過度表達(dá)引起的凋亡不足與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。Livin又名KIAP/ML-IAP，2000年在人基因組庫中篩選克隆出的一種新型、有較強(qiáng)抗凋亡功能的IAPs蛋白家族新成員。Livin基因定位于染色體20q13，全長4.6 kb，包含7個(gè)外顯子及6個(gè)內(nèi)含子，其基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有兩種mRNA亞型，分別編碼298個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)(α)和280個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)(β)，Livin蛋白N端包含1個(gè)BIR結(jié)構(gòu)，C端含1個(gè) RING環(huán)指結(jié)構(gòu)［3］。研究發(fā)現(xiàn)，Livin在黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌和膀胱癌等腫瘤細(xì)胞中及胎盤、胚胎組織中表達(dá)，但在多數(shù)正常成人組織中不表達(dá)。這一表達(dá)的特異性使Livin基因成為目前國際研究的熱點(diǎn)［4］。

Livin的高表達(dá)可能與腫瘤的形成和細(xì)胞增殖活躍密切相關(guān)［5］。本研究腫瘤組Livin陽性表達(dá)率明顯高于正常組，提示Livin的高表達(dá)可能與RB的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Livin陽性表達(dá)與RB的組織分化程度有關(guān)，提示Livin的陽性表達(dá)不但與RB的發(fā)生有關(guān)，還可能與RB的惡性程度呈正相關(guān)，可能是預(yù)后不良的指征?？赡軝C(jī)制:Livin的BIR區(qū)與Caspase結(jié)合，抑制Caspase活性，尤其是抑制 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的活性，從而阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑［6，7］。本研究還發(fā)現(xiàn)Livin陽性表達(dá)與RB臨床分期無明顯相關(guān)性，表明Livin表達(dá)可能與腫瘤的局部浸潤生長無明顯相關(guān)性，也可能因?yàn)楸狙芯坎±龜?shù)較少，有待于大樣本的研究做進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

總之，Livin表達(dá)上調(diào)在RB的發(fā)生、發(fā)展中起促進(jìn)作用，可作為RB早期診斷及預(yù)后的指標(biāo)之一，為RB的基因治療提供新靶點(diǎn)。

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