尹 宏，馬祁生，趙海龍，黃 欣

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤，其發(fā)病率約占全部顱內(nèi)腫瘤的40%～50%，根據(jù)腫瘤細胞的分化程度和增殖潛能等可分成4個不同的等級［1］，通常認(rèn)為Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤屬于低度惡性，而Ⅲ～Ⅳ級則屬于高度惡性。2008年5月～2010年6月，我們檢測了腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及其受體酪氨酸激酶B(TrkB)在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達，旨在進一步探討兩者在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取青海大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本48份(膠質(zhì)瘤組)，患者男25例，女23例;年齡38～73歲;≤50歲28例，＞50歲20例。所有患者均經(jīng)病理證實，且術(shù)前均未接受化療、放療或其他針對腫瘤的治療。按WHO病理分級法分為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級各12例。取正常腦組織48份(正常組)作對照。兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異。主要試劑:兔抗BDNF和TrkB多克隆抗體(一抗，美國CHEMICON);SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(TaKaRa公司);DNA2000(上海生工公司);瓊脂糖(大連寶生物公司);采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物，引物由大連寶生物公司合成。

1.2 BDNF和TrkB蛋白檢測 采用免疫組化法。標(biāo)本組織常規(guī)包埋、切片。常規(guī)的SP法染色，DAB棕色呈色，陰性對照用PBS代替一抗，其余均照說明書操作。BDNF和TrkB蛋白陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):在高倍鏡下隨機選擇10個視野，每個視野至少記數(shù)100個細胞，按每一切片陽性細胞比例及著色深淺計分，采用半定量積分法。BDNF和TrkB蛋白陽性著色主要定位于細胞質(zhì)，以出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性，陽性細胞著色判斷:＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分。陽性強度:無著色或與背景均勻一致的淡黃色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)兩項指標(biāo)的乘積分?jǐn)?shù)進行計分，0～1分為(-)，2～4分為(+)，5～7分為(++)，＞7分為(+++)。

1.3 BDNF和TrkB mRNA檢測 采用RT-PCR法。取出凍存的新鮮標(biāo)本(膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)瘤旁正常腦組織各100 mg)，Trizol法提取組織總 RNA，測定總RNA濃度及純度。使用Takara的M-MLV Rtase cDNA synthesis Kit(codeD6130)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1鏈，接著合成第2鏈(均照說明書操作)。將所得10 μl產(chǎn)物凍存于-20℃以備進行PCR。PCR反應(yīng)體系 50 μl，包括 5 × Buffer 10 μl，TaqDNA 酶 0.2 μl，目的引物 BDNF 及 TrkB 上下游各 1 μl，β-actin引物上下游各 1 μl，cDNA 模板 10 μl，無菌水 25.8 μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性45 s，退火溫度55℃、60 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán);72℃、10 min后終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物于15 g/L的瓊脂糖凝膠做電泳，以無菌水代替cDNA模板的PCR管為陰性對照，天能凝膠成像系統(tǒng)對電泳條帶拍照并進行半定量分析。BDNF及TrkB mRNA相對表達量以同一反應(yīng)體系中目的產(chǎn)物電泳條帶密度指數(shù)與內(nèi)參對照β-actin電泳條帶密度指數(shù)的比值來表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗;計數(shù)資料行χ2檢驗。RT-PCR結(jié)果和免疫組化結(jié)果的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BDNF和TrkB蛋白表達 膠質(zhì)瘤組及正常組BDNF蛋白陽性率分別為 77.1%、41.7%，TrkB 蛋白的陽性率分別為81.2%、54.2%，兩組比較P均＜0.05。

2.2 BDNF和TrkB mRNA表達 膠質(zhì)瘤組及正常組BDNF mRNA的相對表達量分別為0.76±0.15、0.48 ±0.07，TrkB mRNA 的相對表達量分別為0.82±0.09、0.53 ±0.10，兩組比較 P 均 ＜0.05。

2.3 BDNF和TrkB表達與膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 BDNF和TrkB表達與膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系()

表1 BDNF和TrkB表達與膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系()

臨床病理參數(shù) n BDNF 蛋白陽性例%TrkB 蛋白陽性例%BDNF mRNA TrkB mRNA P 值性別男25 19 76 20 80 0.75 ±0.13 0.82 ±0.07 ＞0.05女23 18 78 19 83 0.78 ±0.09 0.83 ±0.08年齡(歲)≤50 28 22 79 23 82 0.77 ±0.11 0.82 ±0.07 ＞0.05＞50 20 15 75 16 80 0.76 ±0.03 0.82 ±0.05病理分級Ⅰ級 12 7 58 7 58 0.62 ±0.12 0.65 ±0.07Ⅱ級 12 8 67 10 83 0.67 ±0.03 0.69 ±0.04 ＜0.05Ⅲ級 12 10 83 10 83 0.78 ±0.10 0.81 ±0.07Ⅳ級12 12 100 12 100 0.82 ±0.14 0.89 ±0.07

2.4 相關(guān)性分析 膠質(zhì)瘤組 BDNF、TrkB蛋白和BDNF、TrkB mRNA 呈正相關(guān)(r=0.805，P 均 ＜0.01)。

3 討論

BDNF是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)合成并廣泛存在于大腦皮層、海馬、基底前腦、下丘腦的最具活性的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一［2］。其通過TrkB參與細胞的增殖分化、黏著與成熟，進而促進中樞神經(jīng)元的發(fā)育、存活、神經(jīng)突起的生長和分支及損傷后的再生修復(fù)［3］。TrkB是BDNF的功能型受體，BDNF與TrkB結(jié)合，誘導(dǎo)TrkB受體形成二聚體，激活內(nèi)在酪氨酸激酶活性使得胞內(nèi)區(qū)酪氨酸殘基自磷酸化;活化的受體能與多個胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用并使其磷酸化從而將胞外信號傳導(dǎo)至細胞內(nèi);在胞內(nèi)則主要通過磷酯酰肌醇-3激酶/Akt、Ras/ERK、PLCγ等通路來發(fā)揮生物學(xué)作用［4］。BDNF能夠阻止神經(jīng)細胞的凋亡，其主要通過高親和力受體TrkB發(fā)揮作用。Sugimoto等［5］在研究表達TrkB的成人神經(jīng)細胞瘤的實驗中觀察，BDNF、NT-4可誘導(dǎo)成神經(jīng)細胞瘤TrkB磷酸化，激活Ras/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進細胞增殖。以往研究表明，BDNF的表達與膠質(zhì)瘤的惡性程度有關(guān)［6］。本研究膠質(zhì)瘤組BDNF和TrkB蛋白、mRNA陽性表達率均高于正常組，提示BDNF和TrkB與膠質(zhì)瘤有關(guān)可能參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)，BDNF和TrkB蛋白、mRNA與腦膠質(zhì)瘤病理分級相關(guān)，且隨惡性程度增高而增加，提示BDNF和TrkB在膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)表達的高低與膠質(zhì)瘤病理級別有密切關(guān)系，BDNF和TrkB的高表達在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要作用。

總之，BDNF和TrkB的表達可反映膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為，可以作為判斷膠質(zhì)瘤惡性程度和預(yù)后的有價值的指標(biāo)。

［1］Louis DN，Ohgaki H，Wiestler OD，et al.The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system［J］.Acta Neuropathol，2007，114(2):97-109.

［2］Yan Q，Rosenfeld RD，Matheson CR，et al.Expression of brain-derived neurotrophic factor protein in the adult rat central nervous system［J］.Neurosci，1997，78(2):431-448.

［3］Skup M，Dwornik A，Macias M，et al.Long-term locomotor training up-regulates TrkB(FL)receptor-like proteins，brain-derived neurot rophic factor，and neurotrophin 4 with different topographies of expression in oligodendroglia and neurons in the spinal cord［J］.Exp Neurol，2002，176(2):289-307.

［4］Almeida RD，Manads BJ，Melo CV，et al.Neuroprotection by BDNF against glutamate induced apoptotic cell death is mediated by ERK and PI3-kinase pathways［J］.Cell Death Diffa，2005，12(10):1329-1343.

［5］Sugimoto T，Ikuroda H，Horii Y，et al.Signal transduction pathways through TRK-A and TRK-B receptors in human neuroblastoma cells［J］.J Cancer Res，2001，92(2):152-160.

［6］Aoyama M，Asai K，Shishikura T，et al.Human neurob lastom as with unfavorable biologies express high levels of brain-derived neurotrophic factorm RNA and a variety of its variants［J］.Cancer Lett，2001，164(1):51-60.