李 娜，張雯雯

(1山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021;2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

貝甲抗癌湯為中藥復(fù)方湯劑，臨床已應(yīng)用多年，證實(shí)其對肝癌有一定的治療效果。2009年11月～2010年10月，我們觀察了中藥貝甲抗癌湯含藥血清(以下簡稱含藥血清)對肝癌細(xì)胞HepG2增殖和凋亡的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 腫瘤細(xì)胞株:人肝癌細(xì)胞株HepG2(山東大學(xué)細(xì)胞生物研究所)。昆明小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量32～38 g(山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。含藥血清:根據(jù)參考文獻(xiàn)［1］制備。主要試劑:DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，Gibco公司)，0.25%胰酶、吖啶橙(AO)、MTT(Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，Hepes公司);主要儀器:超凈工作臺(DL-CJ-2ND，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)，倒置顯微鏡(Nikon公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo公司)，熒光顯微鏡(Olimpus公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HepG2細(xì)胞以適量濃度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加入含10%FBS、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長2～3 d于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞鋪滿約80%傳代。傳代時(shí)吸出培養(yǎng)液，PBS洗1次，胰酶消化，加入新鮮的培養(yǎng)液吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)濃度移入新的培養(yǎng)皿中，添加培養(yǎng)液至適量。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞干預(yù)及增殖抑制率測定 根據(jù)參考文獻(xiàn)［2］制取低濃度、高濃度含藥血清。取對數(shù)生長期細(xì)胞臺盼藍(lán)染色。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至104/ml接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μl/孔(空白孔只加入細(xì)胞培養(yǎng)液 100 μl/孔)，每組設(shè)6個(gè)平行孔。放入37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，吸出培養(yǎng)液后分為三組，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組分別加入低濃度、高濃度含藥血清配置的 DMEM培養(yǎng)液100 μl/孔，對照組加入普通DMEM培養(yǎng)液100 μl/孔，空白孔加入普通 DMEM培養(yǎng)液100 μl/孔。培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)24、48、72 h 后吸出培養(yǎng)液，加入 1 mg/ml MTT 100 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后吸出MTT，加入DMSO 150 μl/孔，微量震蕩器震蕩5 min，使其中的藍(lán)色顆粒充分溶解。將培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀，測定570 nm處吸光度值(OD值)。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 細(xì)胞干預(yù)及凋亡率測定 以5×104/ml的濃度接種對數(shù)生長期細(xì)胞于放置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml。24 h后吸棄培養(yǎng)液細(xì)胞分為三組。實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組分別加入低濃度、高濃度含藥血清配置的DMEM培養(yǎng)液2 ml/孔，對照組加入普通DMEM培養(yǎng)液2 ml/孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h和72 h，細(xì)胞飛片TBS洗5 min，95%乙醇固定5 min。0.01%AO避光染色5 min。熒光顯微鏡下觀察10個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件，應(yīng)用 t檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制率 見表1。由表1可見，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組隨作用時(shí)間延長，其增殖抑制率逐漸增加，P均＜0.01;實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組間各時(shí)點(diǎn)增殖抑制率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率比較(%，)

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率比較(%，)

組別24 h 48 h 72 h實(shí)驗(yàn)1組13.30 ±1.20 38.61 ±1.43 44.98 ±3.16實(shí)驗(yàn)2 組 19.48 ±2.31 36.44 ±1.89 49.00 ±2.32對照組---

2.2 細(xì)胞凋亡率 見表2。

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較(%，)

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較(%，)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別24 h 48 h 72 h實(shí)驗(yàn)1 組 7.40 ±1.28* 17.62 ±2.51* 30.74 ±1.32*實(shí)驗(yàn)2 組 5.25 ±0.49* 14.00 ±1.21* 28.57 ±2.44*對照組1.52 ±0.83 1.34 ±0.11 2.94 ±0.47

3 討論

細(xì)胞凋亡亦稱程序性細(xì)胞死亡，不僅對胚胎發(fā)生、個(gè)體發(fā)育和保持機(jī)體穩(wěn)定等生物學(xué)功能至關(guān)重要，而且在調(diào)控細(xì)胞增殖、腫瘤形成和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。凋亡過程的紊亂可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與惡化。研究表明，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是眾多腫瘤治療方法(如放療、化療、生物治療等)的重要藥理學(xué)機(jī)制和生物學(xué)效應(yīng)之一［2］。

中醫(yī)中藥治療腫瘤具有獨(dú)特的優(yōu)勢。復(fù)方中藥成分多樣，通過多靶點(diǎn)綜合作用以達(dá)到抗癌效應(yīng)，且對正常組織傷害小。研究發(fā)現(xiàn)，部分傳統(tǒng)中草藥有確鑿的抗腫瘤作用［3］:蟾酥提取物通過下調(diào)凋亡相關(guān)基因c-myc等表達(dá)而誘導(dǎo)HL-60、ML-1細(xì)胞凋亡［4］;柑橘素通過下調(diào)Akt和Caspase-3的活性誘導(dǎo)人白血病THP-1細(xì)胞凋亡［5］;三七總皂甙在防治結(jié)直腸癌中有確切療效［6］。但絕大多數(shù)復(fù)方中藥(如本方)成分復(fù)雜，用藥周期較長，確切的抗癌機(jī)制尚不完全明確。對中藥有效成分和其作用機(jī)理的研究是今后工作的重點(diǎn)。貝甲抗癌湯由柴胡、土茯苓、浙貝、炒白術(shù)、莪術(shù)、薏米、炮山甲、甘草等組成，經(jīng)水泡煮沸、去藥渣，最終生藥濃度0.25 g/ml。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組隨作用時(shí)間延長，增殖抑制率逐漸增加;但兩組各時(shí)點(diǎn)增殖抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組各時(shí)點(diǎn)凋亡率均明顯高于對照組，但兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示含藥血清可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，且藥物的時(shí)間—效應(yīng)關(guān)系較明確，即隨著含藥血清作用時(shí)間的延長(24～72 h)細(xì)胞凋亡明顯增加;而劑量—效應(yīng)關(guān)系不明顯，可能與藥物體內(nèi)代謝造成有效代謝產(chǎn)物在血清中含量變化(即含藥血清濃度)有關(guān)。

綜上所述，含藥血清體外對抑制肝癌細(xì)胞生長、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用較明顯。本研究為含藥血清用于肝癌的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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