陳書秀 王虎

（1 山東東方海洋集團(tuán)有限公司 山東煙臺 264003 2 煙臺海融生物技術(shù)有限公司 山東煙臺 265600）

小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)俗稱“小硅藻”，是我國較早培養(yǎng)和應(yīng)用的單胞藻餌料，其個體小，繁殖快，脂肪含量高，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，可作為理想的保健食品，在海水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。目前小新月菱形藻主要采用繼代法來進(jìn)行保存，該方法由于數(shù)次接種容易導(dǎo)致藻種污染或者藻種的遺傳漂變，近幾年固定化藻類的研究正在迅速發(fā)展，在能源生產(chǎn)、污水處理和種質(zhì)保存等領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景，尤其是在保重和次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)方面，引人矚目[1]。本文研究了固定化條件對小新月菱形藻生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料：小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)

1.2 試驗步驟：

1.2.1 載體的制備：稱取海藻酸鈉3g，在開水浴中慢慢攪動(約1h)溶人100 mL蒸餾水中，配成3%(W/V)的凝膠溶液，加人2gNaC1，煮沸消毒備用。以凝膠溶液與鮮藻體積比為4：1的比例接種藻種，充分?jǐn)噭蚝笾瞥赡z～藻混懸液，用注射器吸取混懸液，滴入CaC12溶液中，約30min后形成固化的海藻酸鈣膠珠。用消毒海水洗滌3遍后，按各試驗的要求培養(yǎng)于100mL的三角燒瓶(50mLf/2培養(yǎng)液)中。

1.2.2 實驗設(shè)計

1.2.2.1 膠珠直徑試驗：在實驗室無菌條件下，將藻細(xì)胞與3%海藻酸鈉以體積比1:4混合，在2%CaC12溶液中用不同型號的注射器針頭4.5#、6#、7#分別制備不同直徑的膠珠。藻接種密度為1.74×105cells/mL，膠珠粒數(shù)為200粒，培養(yǎng)液體積為50mL。每組設(shè)3個平行。

1.2.2.2 接種密度試驗：在實驗室無菌條件下，分別將不同密度的藻細(xì)胞與海藻酸鈉混合，在2%CaC12溶液中利用6#針頭制備成膠珠，粒數(shù)為200個，培養(yǎng)液體積為50mL。最終密度為1.75×103、1.75×104、1.75×105、1.75×106，每組設(shè)3個平行進(jìn)行培養(yǎng)。實驗開始后每隔4d測定其細(xì)胞密度。并在此期間定期觀察了各組間的差異。

1.2.2.3 CaCl2濃度試驗 分別配制1%、2%、3%、4%CaC12溶液，滅菌備用。在無菌條件下，將一定密度的微藻藻液與海藻酸鈉混合（體積比為1:4），用6#注射器針頭，分別滴入不同濃度的CaC12溶液中形成膠珠，膠珠個數(shù)為200個，用消毒海水洗滌3遍后，培養(yǎng)于100mL的三角燒瓶(50mL培養(yǎng)液)中，每組設(shè)3個平行。

1.2.2.4 膠珠密度試驗：膠珠密度定義為相同的藻初始接種總密度，相同培養(yǎng)液(體積l00mL)中，三角瓶中膠珠的數(shù)量。將海藻酸鈉一微藻混合液用6#針頭滴于2%的CaC12溶液制備成膠珠，分別設(shè)有數(shù)量為100、200粒、300粒的固定化組，每組設(shè)3個平行進(jìn)行培養(yǎng)。

2 結(jié)果與討論

固定化小新月菱形藻培養(yǎng)4天后在小球內(nèi)形成氣泡，部分膠球上浮，8天左右小球顏色為褐色，球內(nèi)形成菌落，小球大部分沉到瓶底。

2.1 膠球直徑對固定化細(xì)胞生長的影響（見圖1）

從圖1可以看出，開始時6#針頭制作的膠球細(xì)胞生長較快，8d后4.5#針頭制作的膠球細(xì)胞開始迅速增長?？赡苡捎?.5#針頭制作的膠珠個體小，若制作相同數(shù)量的膠珠，最初單位體積內(nèi)接種的細(xì)胞量相對較少，從而導(dǎo)致了較長的延緩期。但從總的生長趨勢來看，針頭越小，膠珠直徑越小，細(xì)胞的生長量越大。膠珠直徑越大，所產(chǎn)生的擴(kuò)散傳質(zhì)阻力越大，膠珠內(nèi)細(xì)胞所需營養(yǎng)不足，積累的代謝產(chǎn)物增多，細(xì)胞生長環(huán)境惡化，同時膠珠內(nèi)部的光照不足[2]，所以這些不利條件使得大直徑的固定化小新月菱形藻生長受阻，又因膠珠越小，制備速度越慢，一般選用6#針頭。24天時更換培養(yǎng)液，藻細(xì)胞繼續(xù)生長。

2.2 接種量對固定化細(xì)胞生長的影響（見表1）

從表1可以看出，接種量越大，其生長量越大。但從生長率來看，初始接種量低于104個細(xì)胞/mL或高于105個細(xì)胞/mL時，生長率較低。所以在對小新月菱形藻進(jìn)行固定化培養(yǎng)時初始接種量最好控制在104-105個細(xì)胞/mL。

2.3 CaCl2濃度對固定化細(xì)胞生長的影響

為獲得處于固定化狀態(tài)的微藻，首先應(yīng)保證固定化膠珠本身具有一定的強(qiáng)度，力粒度和孔隙度等，以防止固定化膠珠散落，同時保證微藻生長過程中底物和代謝物及時進(jìn)出膠珠，維持微藻處于較好的生長條件[3]。從表2可以初步看出，CaCl2濃度較低時，細(xì)胞生長率較高，其中2%的濃度組高于1%的濃度組生長率。

2.4 膠珠密度對固定化細(xì)胞生長的影響

從表3可以看出，膠珠密度越小，細(xì)胞生長率越高，其中200粒/50mL的實驗組稍高于100粒/50mL實驗組的生長率。當(dāng)膠球密度過高時，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)鹽消耗較快，膠珠之間遮光嚴(yán)重，使得光照不足，從而引起藻細(xì)胞衰老和死亡[4]。膠珠密度過低則使其對外界環(huán)境的變化比較敏感，細(xì)胞易受損傷，生長速率較慢[4]。從本實驗結(jié)果來看小新月菱形藻固定化培養(yǎng)時的最佳膠珠密度為200粒/50mL。

2.5 固定化培養(yǎng)與自由化培養(yǎng)比較

采用6#針頭，2%CaCl2，在含50mL培養(yǎng)液的100mL三角瓶中放置200個膠珠，小新月菱形藻有較好的生長速率，按此條件將小新月菱形藻進(jìn)行固定化培養(yǎng)，比較游離和固定化的小新月菱形藻的生長情況，如圖2表明，游離生長的速率明顯高于固定化細(xì)胞的生長速率，但固定化的細(xì)胞生長周期長。細(xì)胞固定化后，生長較緩慢，可能是營養(yǎng)物質(zhì)和光線進(jìn)入膠珠收到一定程度的影響所阻礙的緣故[1]，但在實驗周期內(nèi)，一直處于不斷的生長階段，表明固定化小新月菱形藻具有較長的生長周期，有利于進(jìn)行種質(zhì)保存。

綜上所述，膠粒大小、不同接種量、CaCl2濃度及膠珠密度對小新月菱形藻固定化細(xì)胞產(chǎn)生了顯著的影響，選擇適宜條件可以提高生長速率及生長量。通過對自由化細(xì)胞及固定化細(xì)胞生長曲線的比較，小新月菱形藻可以采用固定化細(xì)胞的方式進(jìn)行保存，保存時間的長短還需要進(jìn)一步的實驗驗證。

[1]張繼紅，馬志珍. 三角褐指藻固定化培養(yǎng)的初步研究[J].海洋水產(chǎn)研究，19（1）：14-17.

[2]李英敏，楊海波，張欣華等. 叉鞭金藻固定化培養(yǎng)的初步研究[J]. 生物學(xué)雜志，19（6）：25-27.

[3]李英敏，楊海波，張欣華等. 鹽藻固定化培養(yǎng)的初步研究[J]. 生物技術(shù)，2001,11（2）47-49.

[4]刑榮蓮，蘇杭，蘇群等. 固定化菱形藻的生長及營養(yǎng)成分變化[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2010,17（2）：274-280.